烟草节杆菌ZL-1及其堆肥低温发酵菌剂的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)ZL‑1，以及烟草节杆菌ZL‑1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，包括步骤：将烟草节杆菌ZL‑1菌液与玉米芯粉按体积质量比2:1(mL/g)混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得烟草节杆菌ZL‑1堆肥低温发酵菌剂；其中，所述烟草节杆菌ZL‑1菌液中活菌数>1×10

Preparation and Application of Arthrobacter Tobacco ZL-1 and Its Low Temperature Fermentation Agent for Composting

【技术实现步骤摘要】
烟草节杆菌ZL-1及其堆肥低温发酵菌剂的制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及一株烟草节杆菌ZL-1，以及含有此烟草节杆菌ZL-1的堆肥低温发酵菌剂的制备方法。
技术介绍
节杆菌属(Arthrobacter)细菌是一类严格好氧菌，广泛分布于土壤和水环境中，在南极和北极的水域中均有发现过节杆菌属细菌。目前，有关节杆菌属细菌的研究集中在氨基酸、维生素和酶产生能力方面。有研究表明，烟草节杆菌作为一种水产益生菌可通过刺激水生动物机体的免疫系统或抑制致病菌的生长来提高水产动物免疫力。另外有报道称，有研究者从日本冲绳县垃圾堆肥化处理后的土壤中分离得到了一种有固氮能力的烟草节杆菌。低温微生物是指在低温条件下具有生长能力的微生物，广泛分布于各种寒冷环境中，并在生态系统中占有独特而重要的地位。低温微生物一般可分为嗜冷型和耐冷型。嗜冷菌的最适生长的温度通常≤15℃，而耐冷菌是指能够在0℃左右生长良好，但最适生长温度＞20℃的微生物。低温微生物作为生态系统中重要而独特的一环，对其进行进一步研究不仅可以深入了解微生物适冷机制，并且其特殊产物如抗冻蛋白、低温酶、多聚不饱和脂肪酸等在环境保护以及食品医药等众多领域中都拥有巨大的应用价值。堆肥技术是一种成本低，可操作性强，生物风险小的畜禽粪污资源化利用方法。此项技术利用微生物代谢活动分解生物大分子，并凭借微生物剧烈活动产生的高温杀灭病原微生物和其他有害物质，最终形成安全绿色的有机肥。然而堆肥易受环境温度的影响，当环境温度较低时，堆体难以快速升温启动，导致粪污无法有效发酵。有研究表明，由于传统的自然堆肥发酵所含土著微生物的种类和数量有限，因此，可以通过向物料中接种外源微生物菌剂来达到提高发酵效率或快速降解生物大分子的目的。与此同时，国内外对于低温型微生物适冷性的研究表明，其独特的感应机制可以使其在低温环境正常代谢，发挥独特的作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一株能够产低温蛋白酶的新型烟草节杆菌，并提供包含该微生物的堆肥低温发酵菌剂的制备方法。该菌剂接种于堆肥堆体中，可以利用其在低温环境中良好的生物活性和分泌低温蛋白酶的功能，提高生物大分子的降解能力，提高堆肥的发酵速率和生物有机肥的品质。为了达到上述目的，本专利技术提供了一株烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)ZL-1，该烟草节杆菌ZL-1于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCCNO.16246。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。一种编码所述烟草节杆菌ZL-1的基因，所述基因序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术所述烟草节杆菌ZL-1，在10℃的低温环境中有良好的生物活性，同时具有降解酪蛋白的功能，利用其在低温环境中代谢产热以及产低温蛋白酶的能力，有助于堆体的快速升温，提高堆肥的发酵速率和生物有机肥的品质。本专利技术还提供了一种烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，包括步骤：将烟草节杆菌ZL-1菌液与载体按体积质量比2:1(mL/g)混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂；其中，所述载体为玉米芯粉；所述烟草节杆菌ZL-1菌液中有效活菌数>1×108CFU/mL优选方式下，所述玉米芯粉能通过40目筛；所述烟草节杆菌ZL-1菌液的制备方法为：S1、制备种子液：取复壮后的烟草节杆菌ZL-1单菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，15℃摇床震荡培养培养48小时，得到烟草节杆菌ZL-1种子液；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基配制比例为：每1000ml中含有牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；S2、制备发酵菌液：按体积比1％的比例将种子液接种到发酵培养基中，15℃摇床震荡培养48h，得到有效活菌数>1×108CFU/mL的烟草节杆菌ZL-1菌液；所述发酵培养基配置比例为：葡萄糖3.0％(g/ml)、蛋白胨1.0％(g/ml)、淀粉3.5％(g/ml)、氯化钠1.0％(g/ml)，余量为水，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；进一步优化，对堆肥低温发酵菌剂进行应用效果评价，具体步骤为：S1、在约为5～10℃的环境温度下，建立堆肥低温发酵菌剂效果评价实验。将新鲜牛粪与秸秆按质量比4:1充分混合，调解含水量约为60％，得牛粪堆体系。将烟草节杆菌ZL-1堆肥发酵菌剂按重量比0.5％接种于长1m、宽0.8m、高1.2m的牛粪堆肥体系中，同时设置未加菌剂的空白对照组。S2、每天记录环境温度和堆体温度，堆体温度测量选用刺入式温度计，测量位置为堆体中心高度以下30cm，每天9:00和17:00测定一次堆体温度后取平均值。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术提供了一株新型烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)ZL-1，该微生物在低温环境中有良好的生物活性，同时具有产低温蛋白酶的功能。2、本专利技术提供了一种包含烟草节杆菌ZL-1的堆肥低温发酵菌剂的制备方法及应用，以玉米芯粉作为载体制备的发酵菌剂，研究结果表明，加入堆肥发酵菌剂的堆体升温快、高温期延长，未加菌剂的对照组始终没有进入高温期，未达到堆肥无害化要求。由此可以证明，堆肥发酵菌剂可以提高堆肥发酵的速率，缩短发酵的周期，提高生物大分子的降解能力和生物有机肥的品质。保藏说明本专利技术涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为ZL-1，分类命名为烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCCNO.16246。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明图1是本专利技术烟草节杆菌ZL-1的菌落形态图；图2是本专利技术烟草节杆菌ZL-1降解酪蛋白效果图；图3是本专利技术烟草节杆菌ZL-1的生长曲线图(15℃)；图4是使用本专利技术制备的烟草节杆菌ZL-1的堆肥低温发酵菌剂在冬季牛粪堆肥实验的温度变化图。具体实施方式以下结合优选实施例对本专利技术的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本专利技术，而不构成对本专利技术技术方案的限制。实施例1：烟草节杆菌ZL-1的分离筛选及鉴定本专利技术的菌株分离自大连心乐乳业奶牛养殖厂的牛粪。1.烟草节杆菌ZL-1的分离筛选(1)称取采集的牛粪样品10g加入到装有90mLPBS缓冲液的三角瓶中，并加入无菌玻璃珠(有助于样品均匀分散在PBS缓冲液中)，在室温条件下、180rpm摇床振荡20min，静置10min，制备菌悬液(即10-1牛粪样品稀释液)；然后用PBS缓冲液进行10倍梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释悬液，选取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的稀释悬液各100μL，均匀涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，10℃恒温培养箱培养72h。在固体培养基平板上挑取形态不同的单菌落至新的固体培养基平板划线，在10℃恒温箱培养，如此重复三次，至微生物菌种纯化。将纯化的菌株转移到固体培养基斜面上，于4℃保存。(2)经过分离纯化，共得到能够在10℃下生长的细菌5株，对5株本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株烟草节杆菌，其特征在于，该烟草节杆菌，菌株名为ZL‑1，分类命名为烟草节杆菌Arthrobacter nicotianae，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏CGMCC，保藏编号CGMCC NO.16246；其基因序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一株烟草节杆菌，其特征在于，该烟草节杆菌，菌株名为ZL-1，分类命名为烟草节杆菌Arthrobacternicotianae，于2018年8月10日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏CGMCC，保藏编号CGMCCNO.16246；其基因序列如SEQIDNo.1所示。2.一种应用权利要求1所述烟草节杆菌ZL-1制备堆肥低温发酵菌剂的方法，其特征在于，包括步骤：将烟草节杆菌ZL-1菌液与载体按体积质量比2:1(mL/g)混合均匀，晾干至含水率≤25％，即得烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂；其中，所述载体为经过121℃高温灭菌20min的玉米芯粉；所述烟草节杆菌ZL-1保藏编号为CGMCCNO.16246，所述烟草节杆菌ZL-1菌液中有效活菌数>1×108CFU/mL。3.根据权利要求2所述烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，其特征在于，所述玉米芯粉能通过40目筛。4.根据权利要求2所述烟草节杆菌ZL-1堆肥低温发酵菌剂的制备方法，其特征在于，所述烟...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓宇，张喆，徐永平，陈岩，王丽丽，侯扶琴，陈红莉，吴妍妍，王思佳，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21