一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒及其制备方法，属于试剂盒制备技术领域，试剂盒包括：（1）固相凝集反应微板；（2）低离子强度溶液；（3）指示系统；（4）阴性对照血清；（5）阳性对照血清；制备方法包括：（1）固相凝集反应微板的制备；（2）低离子强度溶液的制备；（3）指示系统的制备；（4）阴性对照血清制备；（5）阳性对照血清制备；通过创新性的利用单克隆抗体对红细胞的高特异性吸附、利用冷冻干燥保存技术、利用高灵敏度的二步法指示系统，切实解决目前新生儿溶血病检测方法中灵敏度低、红细胞难保存、易漏检抗体等难题，为临床一线检测工作提供一种高性价比的新生儿溶血病实验检测试剂盒。

A Kit for Detecting Neonatal Hemolytic Disease Based on Solid Phase Agglutination Technology and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒及其制备方法，属试剂盒制备

技术介绍
新生儿溶血病(hemolyticdiseaseofnewborn,HDN)是指由于母胎或母婴血型不合引起的同族免疫性溶血。该病发生的机理主要在于：胎儿的血型抗原一半由父亲遗传,另一半由母亲遗传。当胎儿所遗传的父源性血型抗原恰为母体所缺乏时，一旦该父源性红细胞血型抗原在妊娠的中晚期通过胎盘进入母体时,则可以刺激母体产生相应的免疫性血型抗体。这种IgG性质的免疫性抗体又通过胎盘进入胎儿血液循环后，与含有相应抗原的胎儿红细胞相结合，导致后者被致敏。这种致敏的红细胞在胎儿肝、脾的单核-吞噬细胞系统内被破坏，从而引起胎儿或新生儿溶血病的发生，进一步导致死胎、流产或早产。胎儿出生后(即新生儿)容易出现贫血、高胆红素血症，严重者可导致核黄疸甚至危及生命安全。因此，准确的新生儿溶血病实验检测能够为临床提供足够的证据支持，并为临床及时采取对症治疗措施具有重要的参考价值。在现今的36个人类红细胞血型系统中，中国人群以ABO血型不合的溶血病最为常见，约占新生儿溶血病的85.3％；其次为RhD和RhE溶血病，两者约占14.6％[薛辛东,杜立中主编,儿科学,人民卫生出版社,2005年,第一版,139.]，其他的诸如抗-Dia等也有报道[邵华，马署轩.抗-Dia引起的新生儿溶血病1例报告，北京医学，2018，40(2)：170.颜永强，斯景萍，崔毅军.抗-Dia引起新生儿溶血病1例，临床检验与输血，2007，9(1)：78—79.]。因此，无论采用何种实验检测方法，应当针对中国新生儿人群溶血性抗体的实际分布情况进行设计和检测。胎儿或新生儿溶血病的检测实验包括:直接抗人球蛋白实验、游离抗体检测实验、抗体释放检测实验。直接抗人球蛋白实验是利用抗人球蛋白检测患儿红细胞是否被IgG抗体致敏的一项实验。游离抗体检测实验是用特定的试剂红细胞与患儿血浆混合后孵育、洗涤，最后用抗人球蛋白进行检测。如果试剂红细胞出现凝集，则为阳性反应，表明患儿血浆中有游离的溶血性抗体；如果试剂红细胞未出现凝集，则为阴性反应，表明患儿血浆中未检出游离的溶血性抗体。抗体释放检测实验是通过热放散或酸放散将患儿红细胞上结合的抗体释放于放散液中，再用特定的试剂红细胞与放散液混合后孵育、洗涤，最后用抗人球蛋白进行检测。如果试剂红细胞出现凝集，则为阳性反应，表明放散液中有从患儿红细胞上释放的溶血性抗体；如果试剂红细胞未出现凝集，则为阴性反应，表明放散液中未检出溶血性抗体，该项实验是新生儿溶血病的确诊性实验。目前国内各级医疗机构主要采用保存制备的ABO红细胞试剂配以抗人球蛋白微柱凝胶卡法进行新生儿溶血病的实验检测。其原理主要是利用凝胶介质的分子筛作用，将凝胶颗粒悬浮在缓冲液中，灌入微柱卡中制得。实验时，在反应腔中分别加入ABO细胞和待检血清或放散液，孵育一定时间后，再离心观察结果。如果受检标本含有溶血性抗体，则相应的试剂红细胞就会与之发生反应而不能通过凝胶柱的分子筛，最终滞留在凝胶柱的上层或分散于柱中；若受检血清或放散液中不含有溶血性抗体，则游离的试剂红细胞离心后可以通过分子筛而沉积在微柱的底部。该方法受试剂红细胞浓度、离心力和离心时间、凝胶粒径大小、悬浮介质中抗凝剂浓度等因素影响，造成检测的灵敏度容易受到干扰。另一方面，微柱凝胶卡价格相对较高，需要专用配套的孵育和离心设备，限制了其在多数医疗机构的应用。现有的常规检测方法均需要以悬浮于红细胞保存液中的抗体筛选细胞来完成实验。一方面，受制于红细胞本身的寿命和保存液的质量，试剂红细胞的保存期一般小于3个月，如果不及时使用，容易造成浪费；另一方面，试剂红细胞在保存过程中，随着红细胞的衰老，不断的会发生抗原丢失和溶血，可能导致假阴性实验结果出现。因此，有必要对新生儿溶血病的检测实验技术进行研究开拓。固相法是80年代初期由PlappFV等专利技术的一种技术[PlappFV,SinorLT,RachelJM，等.Asolidphaseantibodyscreen.AmJClinPathol,1984,82:179.]。将特定的有机吸附剂包被于96孔微板，利用电荷吸附作用将需要吸附的抗原物质包被于微板孔中，最后用其检测相关的抗体物质。一方面，由于传统的吸附剂包被时间较长，且细胞铺板后还需要进行固定、保湿等步骤，相对耗时耗力；另一方面，包被的红细胞没有经过冻干步骤，使用期限只有24小时。因此，上述的缺陷影响了其在临床中的实际应用。但该法灵敏度高，通过对包被基质、包被后细胞的长期保存技术、指示系统等进行一系列的创新后，其效果将会得到极大改善。目前为止，国内外暂未见有对固相吸附原理经过创新改进后用于新生儿溶血病实验检测方面的试剂盒。综上所述，为克服目前新生儿溶血病实验检测的不足，临床实际检测工作中迫切需要一种操作简便、能够长期保存抗原物质、针对中国新生儿人群高频溶血性抗体且成本适当的新生儿溶血病实验检测试剂盒。红细胞作为一种特殊的细胞，其表面分布有大量的血型抗原分子，这些抗原分子通常具有特异性，即能够与相应的抗体发生免疫反应。当一种固相载体的表面包被了特异性的抗体分子时，红细胞表面所携带的特异性抗原分子就会被结合，这种抗原抗体之间的结合可以将红细胞强有力的固定在固相载体表面。在红细胞冷冻保护液的作用下，这种固定在固相载体表面的红细胞可以突破常规液体保存液的三个月期限，进行长期保存，且膜抗原能够长期保持稳定。
技术实现思路
本专利技术拟将针对红细胞抗原的单克隆抗体包被于96孔微板的内表面，利用其高度的特异性将A、B、O型红细胞分别吸附至微板孔底，经过裂解、加入细胞保护液冷冻干燥后实现长期保存；在冻干后的微板孔中加入待检测的血浆、放散液和促进反应的低离子液，就可以快速实现红细胞抗原与待检测血浆抗体之间的免疫性结合，最后通过高灵敏度的指示系统进行指示，阳性反应将在微板孔底面呈现出均匀一致的指示红细胞单层；阴性反应则将在微板孔中央底面呈现出一个圆形的指示红细胞扣。本专利技术创新性的利用单克隆抗体对红细胞抗原的特异性反应将红细胞固定在固相载体内表面、利用冷冻干燥技术替代常规红细胞的保养液保存、利用高灵敏度的二步法指示系统，可以切实解决目前临床不规则抗体检测方法中灵敏度低、红细胞难以保存、常规方法漏检抗体等难题，为临床一线检测工作提供一种高性价比的新生儿溶血病实验检测试剂盒。本专利技术的一个目的是提供一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，该试剂盒能够解决现有检测方法中灵敏度低、检测用试剂红细胞保存期短、抗体漏检、操作繁琐、成本较高等问题。本专利技术的另一个目的是提供一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒的制备方法。本专利技术提供了一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，该试剂盒包括：固相凝集反应微板、低离子溶液、阴性对照血清、阳性对照血清、指示系统；本专利技术所述的固相凝集反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条组成，微板条材质优选聚苯乙烯，其作用是包被抗红细胞单克隆抗体、固定红细胞抗原膜、容纳受检血浆或放散液、低离子液和指示系统等，本身不参与化学反应；在包被了单克隆抗体的基础上，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：该新生儿溶血病实验检测试剂盒，包括：(1)固相凝集反应微板，所述的固相凝集反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条组成，微板条的U型孔底内表面包被有高特异性的抗红细胞单克隆抗体，已筛选的合格A、B、O型红细胞通过单克隆抗体对红细胞的高特异性免疫反应，被均匀地包被在孔底内表面，经裂解后形成固定于U型孔底内表面的红细胞膜，在此基础上加入细胞膜冷冻保护液，经过冷冻干燥后制备的微板；(2)低离子强度溶液，所述的低离子强度溶液包含甘氨酸和0.1％叠氮化钠；(3)指示系统，所述的指示系统包括指示红细胞和抗人球蛋白试剂；(4)阴性对照血清，是未含有不规则抗体且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清；(5)阳性对照血清，是包含有IgG抗‑D且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清。

【技术特征摘要】
1.一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：该新生儿溶血病实验检测试剂盒，包括：(1)固相凝集反应微板，所述的固相凝集反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条组成，微板条的U型孔底内表面包被有高特异性的抗红细胞单克隆抗体，已筛选的合格A、B、O型红细胞通过单克隆抗体对红细胞的高特异性免疫反应，被均匀地包被在孔底内表面，经裂解后形成固定于U型孔底内表面的红细胞膜，在此基础上加入细胞膜冷冻保护液，经过冷冻干燥后制备的微板；(2)低离子强度溶液，所述的低离子强度溶液包含甘氨酸和0.1％叠氮化钠；(3)指示系统，所述的指示系统包括指示红细胞和抗人球蛋白试剂；(4)阴性对照血清，是未含有不规则抗体且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清；(5)阳性对照血清，是包含有IgG抗-D且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清。2.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，所述的微板条U型孔底内表面已经包被抗红细胞单克隆抗体，其对A、B、O型红细胞的吸附作用具有高度特异性。3.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述的红细胞膜是将包被于96孔U型底微板条的A、B、O型红细胞裂解后所得，其血型系统抗原包括：ABO血型抗原、Rh血型抗原、Kidd血型抗原、MNSs血型抗原、Duffy血型抗原、Luthran血型抗原、Lewis血型抗原、P血型抗原，用于包被的A、B、O型红细胞涵盖下列抗原：D、C、E、c、e、JKa、JKb、M、N、S、s、Fya、Fyb、Lub、P1、Mur抗原。4.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述的细胞膜冷冻保护液为8％的蔗糖溶液。5.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述指示系统中的指示红细胞是指IgG抗-D致敏的O型RhD(+)红细胞悬液，浓度为0.2～0.6％。6.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒，其特征在于：所述指示系统中的抗人球蛋白试剂是指1:1～1:128倍稀释的羊抗人或者兔抗人IgG抗体。7.一种基于固相凝集技术的新生儿溶血病实验检测试剂盒的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)固相凝集反应微板的制备；(2)低离子强度溶液的制备；(3)指示系统的制备；(4)阴性对照血清的制备；...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆宏，罗广平，
申请(专利权)人：骆宏，
类型：发明
国别省市：广东,44