凝集素的分离方法技术

本发明专利技术涉及特别包括甘露糖结合凝集素（ＭＢＬ）的适用于重组产生的凝集素作为原料的凝集素组合物的分离方法和涉及高分子量凝集素的凝集素制品的富集方法。该方法意味着使用糖衍生物修饰的固相支持体，其中固相支持体上一定浓度的糖衍生物用于分离预定的凝集素寡聚体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及特别包括甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)的适合于使用重组生产的凝集素作为原料的凝集素组合物的分离方法和涉及高分子量凝集素的凝集素制品的富集方法。
技术介绍
凝集素是特征在于存在糖结合结构域的蛋白质。胶原凝素是一组含有亚单位寡聚结构的凝集素，每个亚单位含有糖结合结构域。以可产生具有不同分子量的凝集素群的不同数量的亚单位表示体内凝集素。MBL属于胶原凝素族蛋白家族且特征在于各自由与胶原视杆细胞(collagenous rod)结合的钙依赖性C-型糖识别域(CRD)组成的亚单位的寡聚结构。MBL通过相关的丝氨酸蛋白酶(MASP-甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶)、即通过与Clq类似的机制激活补体系统。甘露糖结合蛋白(Mannose-binding protein，MBL)是用于患有与功能和/或临床症状相关的遗传性或获得性MBL-缺乏的患者的取代或置换疗法的蛋白质。将来源于人血浆的MBL装配入各自由三条相同的多肽链组成的亚单位寡聚体。MBL分子中的亚单位数量是可变的，但提示生物活性多肽是由三个以上亚单位组成的寡聚体。血浆含有三个以上亚单位的寡聚体以及变性和结构异常的蛋白质形式，它们例如在SDS凝胶上产生相当于高级寡聚体的显性MBL带之间的带。重组生产的MBL显示出与血浆衍生的MBL相似的寡聚体变化形式。然而，重组生产的MBL通常具有高于血浆衍生的MBL含量的低分子量形式。低分子量形式MBL包括例如单多肽链、单一亚单位和二聚化亚单位。一般通过使包括凝集素的组合物上与用凝集素结合的糖修饰的柱分离凝集素。然而，柱的效力可变。在PCT申请WO 00/70043中描述了从低分子量形式中分离高分子量寡聚体的方法，其中使重组生产的MBL在特定的柱上进行分级分离，其中该柱本身对MBL不具有任何亲和性。
技术实现思路
从溶液中快速而简便分离凝集素、诸如甘露糖结合凝集素(MBL)或其衍生物及其变体(本文共同命名为凝集素)的方法具有显著重要性。此外，控制凝集素的分子量分布也具有显著的重要性，因为所述凝集素多肽类的不同寡聚体具有不同的生物功能和活性。本专利技术描述了凝集素、诸如MBL的分离方法，该方法通过将所述制品施加在与预定浓度的糖衍生物偶联的固相支持体上来进行。该方法用作制备、纯化和/或配制所述多肽过程中的单元操作。与其它方法比较，本专利技术方法有利的是可以用于改变所述多肽寡聚体的组成以便从所述多肽的低分子量寡聚体中分离所述多肽的高分子量寡聚体或从高分子量寡聚体和低分子量寡聚体中分离中间分子量寡聚体。因此，本专利技术的一个目的是提供从包括各种凝集素分子的制品中分离至少一种凝集素的方法，该方法包括下列步骤建立与预定浓度的糖衍生物偶联的固相支持体；将所述制品施加在所述固相支持体上；使所述凝集素结合与所述固相支持体偶联的糖衍生物；用洗涤液洗涤所述的固相支持体以除去未结合的污染物；和任选从所述固相支持体上回收所述凝集素。所谓的术语″预定浓度″指的是将具有预定浓度的糖衍生物的预定体积施加在使糖衍生物与固相支持体偶联的固相支持体的预定体积或面积上。在一个实施方案中，该术语指的是预定浓度的糖衍生物与预定体积或面积的固相支持体偶联。所谓术语″污染物″指的是凝集素制品中的污染物和因其分子量较小而未与所述糖衍生物结合的凝集素。特别当需要中间分子量凝集素时，所述的污染物可以含有使用如下所述的两步或多步法时所需的凝集素。因此，术语″污染物″与包括未结合凝集素在内的未结合物质的含义相同。所谓术语″各种凝集素分子″优选指的是各种凝集素分子的寡聚体，所述的凝集素分子具有诸如如下所述的相同或基本上相同的结构亚单位。本专利技术的第二个目的是提供与预定浓度的糖衍生物共价偶联的这类固相支持体，其中所述的糖衍生物优选是氨基糖。本专利技术的另一个目的涉及改变溶液中凝集素的寡聚体分布的方法。因此，本专利技术在一个实施方案中涉及增加包括各种凝集素分子的组合物中比值R的方法，其中R是具有高于预定分子量的分子量的高凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比，所述的方法包括下列步骤获得包括低分子量凝集素和高分子量凝集素的凝集素制品，所述的制品具有的比值R＝R0；对该制品施用一种分离方法，优选从如上文所述的制品中分离至少一种凝集素的方法；获得包括回收的凝集素分子的组合物。由此获得了具有比原料的高分子量凝集素寡聚体的含量增加的组合物。特别地，所述比值的增加产生了包括具有高于二聚体凝集素分子量的分子量的组合物。因此，本专利技术在另一个方面中涉及包括各种凝集素分子的组合物的生产方法，其中基本上所有所述的凝集素分子均具有高于预定的二聚体凝集素分子量的分子量，所述的方法包括下列步骤获得包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子的凝集素制品，所述的制品具有的比值R＝R0，其中R是具有高于预定分子量的很高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低子量的凝集素分子浓度之比；对该制品施用一种分离方法，优选从如上文所述的制品中分离至少一种凝集素的方法；获得包括回收的凝集素分子的组合物。由于用于所述方法的原料包括高分子量凝集素和低分子量凝集素，所以本专利技术还涉及从凝集素制品中分离包括各种凝集素分子的方法，其中基本上所有所述的凝集素分子均具有高于预定分子量的高分子量，所述的凝集素制品包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于二聚体凝集素分子量的低分子量的凝集素分子，所述的制品具有的比值R＝R0，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比；所述的方法包括下列步骤获得所述的凝集素制品；对该制品施用一种分离方法，优选从如上文所述的制品中分离至少一种凝集素的方法；获得包括回收的凝集素分子的组合物。就大部分目的而言，高分子量凝集素是所需的凝集素；然而，就某些应用而言，则需要低分子量凝集素；且由此本专利技术进一步涉及包括各种凝集素分子的组合物的生产方法，其中基本上所有所述的凝集素分子均具有低于或等于预定分子量的低分子量，所述的方法包括下列步骤获得凝集素制品，该制品包括具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子和具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子，所述的制品具有的比值R＝R0，其中R是具有高于预定分子量的高分子量的凝集素分子浓度与具有低于或等于预定分子量的低分子量的凝集素分子浓度之比；对该制品施用一种分离方法，优选从如上文所述的制品中分离至少一种凝集素的方法；获得包括洗涤液中未结合的凝集素分子的组合物。就上述所有方法而言，优选回收的凝集素分子组合物具有的比值R＝R1，其中R1至少为1。诸如至少为1.05、诸如至少为1.10、诸如至少为1.15、诸如至少为1.25、诸如至少为1.50、诸如至少为1.75、诸如至少为2.0、诸如至少为2.5、诸如至少为3.0、诸如至少为4.0、诸如至少为5.0、诸如至少为6.0、诸如至少为7.0、诸如至少为8.0、诸如至少为9.0、诸如至少为10.0、诸如至少为15、诸如至少为20、诸如至少为30、诸如至少为40、诸如至少为50、诸如至少为60、诸如至少为70、诸如至少为80、诸如本文档来自技高网...

【技术保护点】
从包括各种凝集素分子的制品中分离至少一种凝集素的方法，该方法包括下列步骤：建立与预定浓度的糖衍生物偶联的固相支持体；将所述制品施加在所述固相支持体上；使所述凝集素结合与所述固相支持体偶联的糖衍生物；用洗涤液洗 涤所述的固相支持体以除去未结合的污染物；和任选从所述固相支持体上回收所述凝集素。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：芬恩马西森，
申请(专利权)人：纳蒂芒公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]