一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法，属试剂盒制备技术领域，该试剂盒包括：（1）分检式固相凝集反应微板；（2）低离子强度溶液；（3）指示系统；（4）阴性对照血清；（5）阳性对照血清；制备方法包括：（1）分检式固相凝集反应微板的制备；（2）低离子强度溶液的制备；（3）指示系统的制备；（4）阴性对照血清的制备；（5）阳性对照血清制备；通过创新性的利用单克隆抗体对红细胞的高特异性吸附、利用冷冻干燥保存技术、利用高灵敏度的二步法指示系统，切实解决目前临床不规则抗体检测方法中灵敏度低、红细胞难以保存、易漏检等难题，为临床一线检测工作提供一种高性价比的检测试剂盒。

A Kit for Detecting Irregular Antibody of Erythrocyte Blood Groups Based on Solid Phase Agglutination and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法
本专利技术涉及一种以固相凝集技术为基础的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒及制备方法，属于试剂盒制备

技术介绍
红细胞血型系统不规则抗体是指在人体内除了抗-A和抗-B以外的血型抗体。人红细胞除了ABO抗原外，常见的抗原还有D、C、E、c、e、JKa、JKb、M、N、S、s、Fya、Fyb、Lub等。相应的，针对这些抗原所产生的抗体属于不规则抗体范畴。不规则抗体多数属于免疫性抗体，其产生途径主要有：输血、妊娠、接触天然免疫性抗原物质等。这些抗体以IgG型为主。对于受血者而言，体内存在不规则抗体时，一旦输入对应抗原阳性的红细胞，轻则引起溶血性输血反应，重则危及患者的生命安全；对于献血者而言，如果其体内含有不规则抗体，该抗体一旦被输入含有相应抗原的受血者，同样容易引起输血反应甚至危及生命；对于孕产妇而言，IgG型的不规则抗体透过胎盘进入胎儿体内，则可引发胎儿/新生儿溶血病。因此，国家卫计委在《临床输血技术规范》中，明确规定输血前检查必须包括不规则抗体筛检试验，以降低受血者发生输血反应的风险；在临床产科实践中，也在不断的强化对多次妊娠的孕妇，将不规则抗体的筛查作为孕期保健的常规检测，以降低胎儿/新生儿发生溶血病的风险。目前国内各级医疗机构和采供血机构检测不规则抗体的方法主要是试管法和抗人球蛋白微柱凝胶卡法。试管法主要基于IgM型抗体与相应抗原在盐水介质中的反应进行试验，但不能检出IgG型的不规则抗体。且试管法需要手动振摇观察，容易受操作者个人经验的影响，导致结果判读差异较大。因此，近年来，抗人球蛋白微柱凝胶卡法得到了广泛的应用。其原理主要是利用凝胶介质的分子筛作用，将凝胶颗粒悬浮在缓冲液中，灌入微柱卡中制得。实验时，在反应腔中分别加入抗筛细胞和待检血清，孵育一定时间后，再离心观察结果。如果受检标本含有不规则抗体，则形成的凝集块不能通过凝胶柱的分子筛而滞留在凝胶柱的上层或分散于柱中；若受检血清中无不规则抗体，离心后游离的试剂红细胞可以通过分子筛而沉积在微柱的底部。该方法受试剂红细胞浓度、离心力和离心时间、凝胶粒径大小、悬浮介质中抗凝剂浓度等因素影响，检测的灵敏度容易受到影响，如Kidd血型系统抗体和中国人群的高频不规则抗体抗-Mur等具有剂量效应的抗体，用微柱凝胶卡法检验时，容易漏检造成输血反应[BrianKay,JessicaL.Poisson,ChirstopherW.Tuma,等.Anti-JKathataredetectedbysolid-phaseredbloodcelladherencebutmissedbygeltestingcancausehemolytictransfusionreactions.Transfusion,2016,56:2973-2979.]。另一方面，微柱凝胶卡价格相对较高，需要配套的孵育和离心设备，限制了其在多数医疗机构的应用。固相法是80年代初期由PlappFV等专利技术的一种技术[PlappFV,SinorLT,RachelJM，等.Asolidphaseantibodyscreen.AmJClinPathol,1984,82:179.]。将特定的有机吸附剂包被于96孔微板，利用电荷吸附作用将需要吸附的抗原物质包被于微板孔中，最后用其检测相关的抗体物质。一方面，由于传统的吸附剂包被时间较长，且细胞铺板后还需要进行固定、保湿等步骤，相对耗时耗力；另一方面，包被的红细胞没有经过冻干步骤，使用期限只有24小时。因此，上述的缺陷影响了其在临床中的实际应用。但该法灵敏度高，通过对包被基质、包被后细胞的长期保存技术、指示系统等进行一系列的创新后，其效果将会得到极大改善。现有的常规检测方法均需要以悬浮于红细胞保存液中的抗体筛选细胞来完成实验。一方面，受制于红细胞本身的寿命和保存液的质量，试剂红细胞的保存期一般小于3个月，如果不及时使用，容易造成浪费；另一方面，试剂红细胞在保存过程中，随着红细胞的衰老，不断的会发生抗原丢失和溶血，可能导致假阴性实验结果出现。综上所述，为克服目前不规则抗体检测技术的缺陷，临床实际检测工作中迫切需要一种操作简便、能够长期保存抗原物质、减少抗体漏检且成本适当的红细胞不规则抗体检测试剂盒。红细胞作为一种特殊的细胞，其表面分布有大量的血型抗原分子，这些抗原分子具有高度的特异性，即只能够与相应的抗体发生免疫反应。当一种固相载体的表面包被了特异性的抗体分子时，红细胞表面所携带的抗原分子就会被特异性的结合，这种抗原抗体之间的结合可以将红细胞强有力的固定在固相载体表面。在冷冻保护液的作用下，这种固定在固相载体表面的红细胞可以突破常规液体保存液的三个月期限，进行长期保存，且膜抗原能够长期保持稳定。本专利技术拟将针对红细胞抗原的单克隆抗体包被于96孔微板的内表面，利用其高度的特异性将红细胞吸附至微板孔底，经过裂解、加入细胞保护液冷冻干燥后实现长期保存；在冻干后的微板孔中加入待检测的血浆和促进反应的低离子液，就可以快速实现红细胞抗原与待检测血浆抗体之间的免疫性结合，最后通过高灵敏度的指示系统进行指示，阳性反应将在微板孔底面呈现出均匀一致的指示红细胞单层；阴性反应则将在微板孔中央底面呈现出一个圆形的指示红细胞扣。本专利技术创新性的利用单克隆抗体对红细胞抗原的特异性反应将红细胞固定在固相载体内表面、利用冷冻干燥技术替代常规红细胞的保养液保存、利用高灵敏度的二步法指示系统，可以切实解决目前临床不规则抗体检测方法中灵敏度低、红细胞难以保存、常规方法漏检抗体等难题，为临床一线检测工作提供一种高性价比的红细胞血型不规则抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，该试剂盒能够解决现有检测方法中红细胞保存期短、抗体漏检、操作繁琐、成本较高等问题。本专利技术的另一个目的是提供一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒的制备方法。本专利技术提供一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：分检式固相凝集反应微板、低离子溶液、阴性对照血清、阳性对照血清、指示系统；上述的分检式固相凝集反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条组成，微板条材质优选聚苯乙烯，其作用是包被红细胞单克隆抗体、固定红细胞抗原膜、容纳受检血浆、低离子液和指示系统等，本身不参与化学反应；在包被了红细胞单克隆抗体的基础上，将Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc号抗筛细胞分别固定在微板条U型孔底，经过裂解、洗涤后加入细胞膜冷冻保护液进行冷冻干燥，即为已包被抗筛细胞膜的96孔U型底分检式固相凝集反应微板，可用于固相凝集反应实验；与传统固相法不同的是，本专利技术采用对红细胞具有高度特异性的抗红细胞单克隆抗体作为包被基质，非传统固相所用的有机包被介质(如美兰)，对铺板的抗筛红细胞具有高度特异的吸附作用，从而将红细胞固定在U型微板孔底，形成均匀的红细胞分子单层，经过冷冻干燥后保存，不需要保湿过夜等，节省了包被时间，提高了红细胞的铺板效率；上述微板中的抗筛细胞膜是分别将编码为Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc号的抗筛细胞包被于96孔U型底微板条内表面后,经过细胞裂解液裂解后所得，其血型系统抗原包括：Rh血型抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，其特征在于：该分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，包括：(1)分检式固相凝集反应微板，所述的分检式固相凝集反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条组成，微板条的U型孔底内表面包被有高特异性的抗红细胞单克隆抗体，已筛选的Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc号抗筛细胞通过单克隆抗体对红细胞的高特异性反应，分别被均匀地包被在孔底内表面，经裂解后形成固定于U型孔底内表面的分检式抗筛红细胞膜，在此基础上加入细胞膜冷冻保护液，经过冷冻干燥后制备的微板条；(2)低离子强度溶液，所述的低离子强度溶液包含甘氨酸和0.1％叠氮化钠；(3)指示系统，所述的指示系统包括指示红细胞和抗人球蛋白试剂；(4)阴性对照血清，是未含有不规则抗体且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清；(5)阳性对照血清，是包含有IgG抗‑D且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清。

【技术特征摘要】
1.一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，其特征在于：该分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，包括：(1)分检式固相凝集反应微板，所述的分检式固相凝集反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条组成，微板条的U型孔底内表面包被有高特异性的抗红细胞单克隆抗体，已筛选的Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc号抗筛细胞通过单克隆抗体对红细胞的高特异性反应，分别被均匀地包被在孔底内表面，经裂解后形成固定于U型孔底内表面的分检式抗筛红细胞膜，在此基础上加入细胞膜冷冻保护液，经过冷冻干燥后制备的微板条；(2)低离子强度溶液，所述的低离子强度溶液包含甘氨酸和0.1％叠氮化钠；(3)指示系统，所述的指示系统包括指示红细胞和抗人球蛋白试剂；(4)阴性对照血清，是未含有不规则抗体且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清；(5)阳性对照血清，是包含有IgG抗-D且加入0.10％叠氮化钠的健康人血清。2.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的微板条U型孔底内表面已经包被抗红细胞单克隆抗体，其对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号抗筛红细胞的吸附作用具有高度特异性。3.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的分检式抗筛红细胞膜是指Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc号抗筛红细胞分别包被于U型孔底内表面，经裂解后形成的单层分检式细胞膜，其互补抗原谱至少包括：D，C，E，c，e，JKa，JKb，Lub，k，M，N，S，s，Fya，P1，Mur，Dia抗原；3个单人份红细胞的Rh抗原表型应分别为：CCDee，ccDEE，CcDEe。4.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的细胞膜冷冻保护液为8％的蔗糖溶液。5.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，其特征在于：所述指示系统中的指示红细胞是指IgG抗-D致敏的O型RhD(+)红细胞悬液，浓度为0.2～0.6％。6.根据权利要求1所述的一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒，其特征在于：所述指示系统中的抗人球蛋白试剂是指1:1～1:128倍稀释的羊抗人或者兔抗人IgG抗体。7.一种基于固相凝集技术的分检式红细胞血型不规则抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)分检式固相凝集反应微板的制备；(2)低离子强度溶液的制备；(3)指示系统的制备；(4)阴...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆宏，罗广平，
申请(专利权)人：骆宏，
类型：发明
国别省市：广东,44