一种新型骨肉瘤肺转移模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种新型骨肉瘤肺转移模型的构建方法及其应用。本发明专利技术针对REGγ设计了敲除效果显著的siRNA和shRNA的序列，并构建了包含上述序列的慢病毒载体，通过尾静脉注射细胞法来构建裸鼠骨肉瘤肺转移模型，结果证实包含本发明专利技术siRNA和shRNA的构建物能够显著降低REGγmRNA和蛋白表达量，且构建的骨肉瘤肺转移模型可明显观察细胞生长及转移情况。对于未来骨肉瘤靶向药物的探索提供了新的研究思路。

Construction and application of a new lung metastasis model of osteosarcoma

【技术实现步骤摘要】
一种新型骨肉瘤肺转移模型的构建方法及其应用
本专利技术涉及肿瘤分子生物学
，具体地说，是一种新型骨肉瘤肺转移模型的构建方法及其应用。
技术介绍
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见原发性恶性骨肿瘤，发病率男性高于女性，骨肉瘤可发生在各个年龄段，尤其好发于青少年，约占青少年肿瘤的5％，每年全世界发病率为1-3/100万人。具有很强侵袭性，其恶性程度高，病人预后极差，尤其是早期发生肺转移后患者生存期急剧缩短。目前尚无有效治愈的治疗方法。骨肉瘤好发于生长快速的骨组织，疾病进展迅速，可于短时间内发生肺转移，治疗效果不佳，5年生存率低，不但对于骨肉瘤患者及家庭造成巨大痛苦，而且影响了我国医疗资源的配置。蛋白酶体激活因子REGγ，也被称为PSME3(Proteasomeactivatorcomplexsubunit3)、PA28γ或11Sγ。属于蛋白酶体激活因子REG(又名11S)家族的成员之一，以非泛素化和非ATP依赖的方式降解蛋白质。近年来，越来越多的研究表明，REGγ在多种肿瘤中出现了异常表达并于肿瘤的发生发展密切相关。REGγ主要通过降解多种靶蛋白并调控相关的信号通路参与肿瘤的发生发展。针对REGγ与肿瘤的研究已成为国内外领域研究的热点，REGγ已经证实与多种肿瘤的增殖、迁移的恶性肿瘤学行为关系密切，但未有骨肉瘤的相关研究报道。尽管目前术前新辅助化疗结合手术技术的提高，骨肉瘤患者的生存期及生活质量较以往得到了极大的改善，但对难治、复发及对化疗药物不敏感的骨肉瘤患者来说，其预后情况仍不乐观。近些年来，针对肿瘤细胞的基因靶向治疗已经成为国内外肿瘤领域研究的热点和前沿。同时，作为蛋白酶体系中重要的一员—REGγ对于多种肿瘤的发生发展过程的生物学作用前期已有大量研究报道。对于特定瘤肿，针对肿瘤细胞特异性靶点的靶向药物可以精准杀灭肿瘤细胞，通过研制针对骨肉瘤的新型靶向药物可极大的改善复发、难治性骨肉瘤患者的预后情况。而针对REGγ基因的肺转移小鼠模型的建立，对于未来骨肉瘤靶向药物的研制意义重大。本专利通过构建REGγ敲减细胞系，并进一步通过尾静脉注射骨肉瘤细胞法，构建一种新型在骨肉瘤中的表达及功能研究展开研究。传统的骨肉瘤模型多是通过胫骨平台注射或皮下荷瘤，无法观察骨肉瘤的肺脏转移特性，尤其是其肺转移特点。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一门基因阻断技术，为一种双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上阻断特异基因的表达或使其沉默的过程，即序列特异性的转录后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。采用RNAi技术研究基因在肿瘤发病过程中行使的功能是对肿瘤发病机制研究的重要补充。而且目前RNAi已成为肿瘤基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等表达来抑制肿瘤的发生和发展。专利技术人针对现有技术的缺陷，设计了本专利一种新型骨肉瘤肺转移构建方法，这对于骨肉瘤肺转移模型的建立以及靶向药物的探索提供了新的研究思路，对于骨肉瘤的基础研究意义重大。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供针对REGγ，具备药物和研发试剂开发前景的siRNA分子、相关产品及其用途。本专利技术的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种新型骨肉瘤肺转移模型的构建方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：第一方面，本专利技术提供了一种siRNA分子，所述的siRNA分子包含以下序列：正义链：CAGAAGACTTGGTGGCAAA(SEQIDNO:1)，反义链：TTTGCCACCAAGTCTTCTG(SEQIDNO:2)。第二方面，本专利技术提供了一种shRNA分子，所述的shRNA分子包含以下序列：正义链：GGTTCTGAGAGTAAAATTATT(SEQIDNO:3)，反义链：AATAATTTTACTCTCAGAACC(SEQIDNO:4)。第三方面，本专利技术提供了一种构建物，，所述的构建物包含以下shRNA分子序列：正义链：GGTTCTGAGAGTAAAATTATT(SEQIDNO:3)，反义链：AATAATTTTACTCTCAGAACC(SEQIDNO:4)。作为一个优选例，所述的构建物为慢病毒载体。第四方面，本专利技术提供了一种慢病毒颗粒，所述的慢病毒颗粒包含如上所述的构建物、psPAX2和VsVg/PMD2G，所述慢病毒颗粒由以下体积配比的物质构成：psPAX2：VsVg/PMD2G：慢病毒载体＝2:1:2，其中psPAX2与VsVg/PMD2G是慢病毒包装质粒。第五方面，本专利技术提供了一种骨肉瘤稳转细胞系，所述的细胞系包含如上所述的构建物。第六方面，本专利技术提供了如上所述的siRNA分子、shRNA分子、构建物、慢病毒颗粒、骨肉瘤稳转细胞系在非治疗目的的抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移或侵袭中的应用。第七方面，本专利技术提供了如上所述的siRNA分子、shRNA分子、构建物、骨肉瘤稳转细胞系、慢病毒颗粒在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。第八方面，本专利技术提供了如上所述的siRNA分子、shRNA分子、构建物、骨肉瘤稳转细胞系、慢病毒颗粒在制备抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移或侵袭的试剂中的应用。作为一个优选例，所述的骨肉瘤细胞来自于骨肉瘤143B细胞。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种新型骨肉瘤肺转移模型的构建方法，所述方法包括以下步骤：取如上所述骨肉瘤稳转细胞系导入动物体内得到新型骨肉瘤肺转移模型。作为一个优选例，所述构建方法还包括以下步骤：动物活体成像系统检测骨肉瘤细胞肺脏分布、组织蜡块切片制作与免疫组化染色和肺转移组织HE染色。作为一个优选例，所述骨肉瘤稳转细胞系导入动物体内是通过尾静脉注射细胞法将骨肉瘤稳转细胞系导入动物体内。本专利技术优点在于：1、针对REGγ设计了合适的siRNA和shRNA的序列，并构建了包含上述序列的慢病毒载体。实验表明，本专利技术的siRNA和shRNA的构建物能够显著降低REGγmRNA和蛋白表达量，敲除作用十分明显，显著优于其他siRNA和shRNA，因此能开发为小分子治疗药物，或研究骨肉瘤病理机制的研发制剂。2、首次通过尾静脉注射法，注射REGγ敲除的骨肉瘤细胞，并构建对照组细胞观察比较；通过IVIS活体成像系统检测骨肉瘤细胞生长情况，能够动态观察到通过尾静脉接种的骨肉瘤细胞的生长及转移情况。3、解剖肺组织，处理肿瘤组织，通过将肺组织固定、包埋制作转移灶蜡块，并制片行HE染色观察肿瘤组织生长情况，进而，将骨肉瘤组织剪碎处理，通过WB实验进一步从蛋白表达水平检测肿瘤细胞REGγ敲除情况，本专利技术的构建方法得到的模型可用于将来骨肉瘤药物REGγ靶点的检测。附图说明附图1是稳转细胞WB结果：143BshR中REGγ表达量明显减低。附图2是骨肉瘤细胞尾静脉接种后第24h、24dIVIS成像。附图3是骨肉瘤肺转移模型肺组织骨肉瘤转移情况。附图4是骨肉瘤肺转移模型两组骨肉瘤转移瘤数量比较。附图5是骨肉瘤转移模型组织HE染色情况。附图6是骨肉瘤肺转移模型肿瘤组织REGγ表达情况。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子包含以下序列：正义链：CAGAAGACTTGGTGGCAAA，反义链：TTTGCCACCAAGTCTTCTG。

【技术特征摘要】
1.一种siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子包含以下序列：正义链：CAGAAGACTTGGTGGCAAA，反义链：TTTGCCACCAAGTCTTCTG。2.一种shRNA分子，其特征在于，所述的shRNA分子包含以下序列：正义链：GGTTCTGAGAGTAAAATTATT，反义链：AATAATTTTACTCTCAGAACC。3.一种构建物，其特征在于，所述的构建物包含以下shRNA分子序列：正义链：GGTTCTGAGAGTAAAATTATT，反义链：AATAATTTTACTCTCAGAACC。4.根据权利要求3所述的构建物，其特征在于，所述的构建物为慢病毒载体。5.一种慢病毒颗粒，其特征在于，所述的慢病毒颗粒包含权利要求3所述的构建物、psPAX2和VsVg/PMD2G，所述慢病毒颗粒由以下体积配比的物质构成：psPAX2：VsVg/P...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建如，刘玉杰，李林，李磊，万维，罗静，高欣，许克寒，李博，高晓，何韶辉，杨明磊，
申请(专利权)人：上海长征医院，
类型：发明
国别省市：上海,31