用于对阿尔茨海默病的鉴别诊断的组合测试制造技术

本发明专利技术提供了一种组合的免疫红外测定法，用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类分为不同的疾病阶段。该方法可用于确保疾病诊断和患者分层。该测试考虑了体液中淀粉样‑β肽和Tau蛋白二级结构分布的变化的无标记检测。这种从天然到β‑片层富集的亚型的二级结构变化在临床疾病表现之前很多年就出现。现在，组合方法利用这种位移进行基于液体活组织检查的诊断。

Combination test for differential diagnosis of Alzheimer's disease

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对阿尔茨海默病的鉴别诊断的组合测试本专利技术提供了一种组合的免疫红外测定法，用于将阿尔茨海默病进行鉴别诊断和亚分类以分为不同的疾病阶段。该方法可用于确保疾病诊断和患者分层。该测试考虑了体液中淀粉样-β肽和Tau蛋白二级结构分布的变化的无标记检测。这种从天然到β-片层富集的亚型的二级结构变化对于Aβ和Tau延时发生，但在临床疾病表现之前很多年就出现。现在，组合方法利用这种位移进行基于液体活组织检查的诊断。
技术介绍
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病之一，其影响全世界超过3500万人(Prince等人，London，UKdoi:10.1111/j.0963-7214.2004.00293.x(2015))。AD的鉴别诊断和亚分类，特别是疾病的早期或前驱阶段的分类，在临床常规中仍然具有挑战性。目前需要用于早期检测AD的可靠生物标记物。但有保证和早期鉴别诊断是未来治疗干预的基础(Chiba，NeurodegenerativeDiseases，UdayKishore编辑，181–225.InTechdoi:10.5772/55293(2013)；Thorsett和Latimer，CurrentOpinionChem.Biol.4(4):377-82(2000))。因此，科学研究机构正在关注优选基于液体活检的简单诊断测试(Doecke，Arch.Biol.69(10):1318doi:10.1001/archneurol.2012.1282(2012)；Andreasen等人，J.Neurology，NeurosurgeryandPsychiatry64(3):298–305(1998)；Fiandaca等人，FrontiersinNeurology6(Nov):1-13doi:10.3389/fneur.2015.00237(2015)；Mapstone等人，NatureMedicine20(4):415-18.doi:10.1038/nm.3466(2014))。在阿尔茨海默病中，大多数本身无序的淀粉样-β(Aβ)肽和Tau蛋白变为β-片层富集的亚型的二级结构变化被讨论为疾病进展期间的起始事件(Sarroukh等人，Cell.Mol.LifeSci.68(8):1429-38doi:10.1007/s00018-010-0529-x(2011)；Cerf等人，Biochem.J.421(3):415-23doi:10.1042/BJ20090379(2009)；等人，Prion3(2):89-93(2009)；Sachse等人，PNAS105(21):7462-66doi:10.1073/pnas.0712290105(2008)；Glabe，J.Biol.Chem.283(44):29639-43doi:10.1074/jbc.R800016200(2008)；Cavallucci等人，Mol.Neurobiol.doi:10.1007/s12035-012-8251-3(2012)；Haass和Selkoe，NatureRev.Mol.CellBiol.8(2):101-12doi:10.1038/nrm2101(2007)；Kolarova等人，Int.J.Alzheimer'sDiseasedoi:10.1155/2012/731526(2012)；Yang等人，Devel.BrainRes.156(2):127-38doi:10.1016/j.devbrainres.2005.02.004(2005))。因此，提出了Tau聚集和沉积到神经元纤维缠结(NFT)中伴随Aβ聚集(Lo等人，Arch.Neurol.68(10):1257–66doi:10.1001/archneurol.2011.123(2011)；Bennett等人，Arch.Neurol.61(3):378-84doi:10.1001/archneur.61.3.378(2004)；Coomaraswamy等人，PNAS107(17):7969-74doi:10.1073/pnas.1001056107(2010)；Braak和Braak，ActaNeuropathologica82(4):239-59doi:10.1007/BF00308809(1991)；Thal等人，J.Neuropath.Exp.Neurol.59(8):733-48.(2000)；Thal等人，ScienceofAgingKnowledgeEnvironment2006(6):re1doi:10.1126/sageke.2006.6.re1(2006))。在临床中，常规神经心理学测试和脑脊液(CSF)中不同生物标记物水平的神经化学定量结果被用于现有技术的鉴别诊断。但是生物标记物浓度本身，如Aβ40、Aβ42、总Tau或过度磷酸化的Tau水平，可能与AD进展无关(Wiltfang等人，JNeurochem.，101(4):1053-59doi:10.1111/j.1471-4159.2006.04404.x(2007)，Gabelle等人，JAlzheimersDis.，26(3):553-63doi:10.3233/JAD-2011-110515(2011)，Blennow等人，JNutrHealthAging，13(3):205-8doi:10.1007/s12603-009-0059-0(2009))。此外，基于这些生物标记定量，鉴别诊断仍然具有挑战性。然而，正电子发射断层扫描(PET)和磁共振断层扫描(MRT)检测到聚集物(β-片层富集的蛋白累积)，例如人脑中的斑块。然而，PET和MRT是非常昂贵且耗时的技术，其不适用于前驱AD阶段的检测，因此仅提供疾病的中期/晚期阶段的确定。另一个缺点是在PET的情况下使用造影剂，其也给患者带来压力。除了已经提到的技术之外，基于荧光的免疫测定是新兴领域，尤其是酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于表面的荧光强度分布分析(sFIDA)。但是这些技术需要荧光标记的检测抗体，其可以影响分析的生物标记物的二级结构。此外，ELISA和sFIDA未显示关于蛋白质二级结构或二级结构分布的任何直接信息。此外，迄今为止，Tau蛋白的二级结构从未用于诊断或鉴别目的，因为所述技术缺乏构象敏感性。为了确定这种二级结构变化，傅里叶变换红外-(FTIR)差异光谱是一种强有力的工具(和Gerwert，Chemphyschem6(5):881-888doi:10.1002/cphc.200400504(2005))。由肽键的C＝O振动引起的酰胺I带的频率指示蛋白质骨架的二级结构。特别是，通过表面探测衰减全反射(ATR)技术的监测所得的频率向下位移至1630cm-1，可以可靠地检测体液中β-片层富集的生物标记亚型的增加。为了分析体液中特定蛋白质的二级结构分布，目标蛋白质必须选择性地结合在表面层内，这是通过抗体功能化内反射元件(IRE)实现的(Schartner等人，JACS135(10):4079-87doi:10.1021/ja400253p(2013))。该方法用于提取和测定CSF和血浆中可溶性Aβ级分的二级结构分布，用于中度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类分为不同疾病阶段的方法，其通过直接分析体液中可溶性淀粉样‑β(Aβ)肽级分和可溶性Tau蛋白级分的二级结构分布，包括以下步骤：(a)在包含第一红外传感器元件的第一IR池中传导至少一通量的具有可溶性Aβ肽的体液，所述第一红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Aβ肽的受体，所述Aβ肽的至少一种受体为能够特异性和构象独立地结合Aβ肽的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用不与Aβ肽交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团，使IR光束通过所述第一IR池，并从其获得红外光谱；(b)在包含第二红外传感器元件的第二IR池中传导至少一通量的具有可溶性Tau蛋白的体液，所述第二红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Tau蛋白的受体，所述Tau蛋白的至少一种受体为能够特异性和构象独立地结合Tau蛋白的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用不与Tau蛋白交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团；使IR光束通过所述第二IR池，并从其获得红外光谱；和(c)分析获得的红外光谱以确定所述体液中可溶性Aβ肽和可溶性Tau蛋白的二级结构分布以用于鉴别诊断，其中Aβ肽和/或Tau蛋白的酰胺I带的向下位移指示疾病阶段。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.21 EP 16199805.91.用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类分为不同疾病阶段的方法，其通过直接分析体液中可溶性淀粉样-β(Aβ)肽级分和可溶性Tau蛋白级分的二级结构分布，包括以下步骤：(a)在包含第一红外传感器元件的第一IR池中传导至少一通量的具有可溶性Aβ肽的体液，所述第一红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Aβ肽的受体，所述Aβ肽的至少一种受体为能够特异性和构象独立地结合Aβ肽的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用不与Aβ肽交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团，使IR光束通过所述第一IR池，并从其获得红外光谱；(b)在包含第二红外传感器元件的第二IR池中传导至少一通量的具有可溶性Tau蛋白的体液，所述第二红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Tau蛋白的受体，所述Tau蛋白的至少一种受体为能够特异性和构象独立地结合Tau蛋白的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用不与Tau蛋白交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团；使IR光束通过所述第二IR池，并从其获得红外光谱；和(c)分析获得的红外光谱以确定所述体液中可溶性Aβ肽和可溶性Tau蛋白的二级结构分布以用于鉴别诊断，其中Aβ肽和/或Tau蛋白的酰胺I带的向下位移指示疾病阶段。2.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二IR池的红外透明材料独立地选自硅、锗、硒化锌、硒化镓和金刚石，并且优选为锗。3.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二红外传感器元件包含锗内部反射元件，该锗内部反射元件具有梯形或平行四边形形状并且在红外线中是透明的，具有足够的信噪比以检测酰胺I带，且所述Aβ肽或所述Tau蛋白的至少一种受体分别是能够特异性和构象独立地结合Aβ肽或Tau蛋白的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部锗反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用分别不与Aβ肽或Tau蛋白交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团。4.权利要求1或3所述的方法，其中所述内反射元件(i)是锗单晶，优选为梯形切口锗单晶；和/或(ii)允许或提供多于一路红外线通过反射元件；和/或(iii)进一步适用于通过另一种光学方法进行的替代或平行分析，该另一种光学方法包括检测不同波长的荧光；和/或(iv)不与所述Aβ肽或所述Tau蛋白交叉反应的阻断物质选自酪蛋白、乙醇胺、L-赖氨酸、聚乙二醇、白蛋白及其衍生物。5.权利要求1、3或4所述的方法，其中所述硅烷和硫醇接头包括均质硅烷和硫醇接头、硅烷接头的混合物和硫醇接头的混合物，且具有不多于20个原子或不多于15个原子的有效接头链长，优选地，该硅烷接头具有下式之一：(i)X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z，(ii)X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z或(iii)X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z，且该硫醇接头具有下式：(iv)WS-(CH2)n-Y-(CH2)n’-Z,...

【专利技术属性】
技术研发人员：K格沃特，A纳伯斯，J沙尔特纳，
申请(专利权)人：波鸿鲁尔大学，
类型：发明
国别省市：德国,DE