一种鉴定山茶花色芽变品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，利用高效液相色谱–光电二极管阵列检测和超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱联用技术对山茶品种红色花瓣及其粉色与白色芽变品种花瓣中花青苷成分与含量进行研究，结合花色表型分析，对山茶花色芽变进行有效鉴定，明确山茶花色芽变与花青苷之间的关系，揭示山茶花色芽变形成的物质基础，从而为山茶花色芽变育种提供科学依据。

A Method for Identifying Varieties of Camellia Flower Color Bud Change

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定山茶花色芽变品种的方法
本专利技术涉及一种利用花色及花瓣中花青苷成分与含量鉴定山茶花色芽变的方法，属于生物

技术介绍
山茶(Camelliajaponica)品种冬春季节开花，观赏价值高、适应性强，是园林绿化及盆栽重要的木本花卉，在国内外广泛应用。山茶花色变异丰富，其原始花色为红色，通过芽变可产生粉色、白色及复色品种，如通过芽变已从山茶‘红芙蓉’、‘红嫦娥彩’和‘红五宝’等开红色花的品种中选育出相应的粉色和白色品种。植物花色色素主要包括类黄酮、类胡萝卜素和生物碱，山茶属植物花色色素成分主要为类黄酮，包括山茶红色花瓣中的花青苷类和金花茶(C.nitidissima)类黄色花瓣中的黄酮醇类等。研究山茶及其芽变品种不同花色花瓣中花青苷成分与含量，明确山茶花色芽变与花青苷关系对山茶花色的芽变育种具有重要意义。到目前为止，山茶属花青苷研究主要集中于部分山茶物种及开红色花的品种上，山茶品种花瓣中花青苷成分与花色的关系及不同花色形成机制尚不清楚。山茶花色主要为红色，通过芽变极易形成粉色和白色变异品种。芽变选育为山茶育种重要方法，但目前关于山茶及其粉色、白色芽变品种花色芽变的物质基础尚不清楚，极大地限制了山茶花色的芽变育种。因此必须寻找一种高效便捷的鉴定山茶花色芽变品种的方法，明确山茶花色芽变与花青苷之间的关系，为山茶花色芽变育种提供科学依据。目前，关于芽变品种的鉴定主要应用分子标记技术，如苹果、梨等果树中应用ISSR或SSR等分子鉴定其芽变，关于利用花色及花瓣中花青苷成分与含量鉴定山茶花色芽变品种方面尚未见相关报道。本专利技术利用高效液相色谱–光电二极管阵列检测和超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱联用技术对山茶品种红色花瓣及其粉色与白色芽变品种花瓣中花青苷成分与含量进行研究，结合花色表型分析，对山茶花色芽变进行有效鉴定，明确山茶花色芽变与花青苷之间的关系，揭示山茶花色芽变形成的物质基础，为山茶花色芽变育种提供科学依据。
技术实现思路
本专利技术利用高效液相色谱–光电二极管阵列检测和超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱联用技术对山茶品种红色花瓣及其粉色与白色芽变品种花瓣中花青苷成分与含量进行研究，结合花色表型分析，对山茶花色芽变进行有效鉴定，明确山茶花色芽变与花青苷之间的关系，揭示山茶花色芽变形成的物质基础，从而为山茶花色芽变育种提供科学依据。提出一种鉴定山茶花色芽变品种的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，其特征在于：所述鉴定方法具体如下：一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，其特征在于：所述鉴定方法具体如下：步骤1，花色测定：采集山茶品种测定花色的L*、色相a*值、色相b*值、彩度C*值和色调角h，花色测定位置为花瓣上表皮中央部位，光源为C/2°；每样品测量5朵花的花色，数据列表，取平均值；步骤2，定性分析：取山茶品种新鲜花瓣0.6g，液氮研磨至粉末加提取液2mL，浸提24h后用0.22μm滤膜过滤，滤液保存在-20℃冰箱备用；利用高效液相色谱–光电二极管阵列检测(HPLC–DAD)和超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱(UPLC–Q–TOF–MS)联用技术对花瓣中花青苷成分进行定性分析，联用技术采用超高效液相色谱系统和质谱系统，采用UNIFI1.8软件系统，色谱柱为ACQUITYBEHC18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流速：0.3mL·min-1，进样量：2μL，柱温40℃；以0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，洗脱程序为0—1.5min，5％B；1.5—11min，5％—40％B；11—14min，40％—95％B；14—16.5min，95％B；16.5—16.8min，95％—5％B；16.8—20min，5％B；电喷雾电离离子源(ESI)，正离子模式，全离子扫描，扫描范围(m/z)：50-1200u；脱溶剂气体为高纯度氮气，温度为450℃，流速为600L·h-1，毛细管电压为1kV，锥孔电压为40V；低能量扫描电压为6eV，高能量扫描电压为20—45eV；根据UPLC–Q–TOF–MS图谱，检测到若干种花青苷成分，根据Cy糖苷在513—520nm有特征吸收峰及碎片离子m/z287，推测若干种花青苷均为Cy型花青苷；步骤3，定量分析：运用HPLC–DAD方法，在525nm处检测花瓣中花青苷；采用标准品半定量法分别计算花瓣中含有的相对于标准品矢车菊素–3–O–β–葡萄糖苷(cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy3G)的花青苷含量，重复3次。进一步的，采用分光色差仪对花色测定，CIEL*a*b*体系中，L*表示花色明暗变化程度；色相a*值表示花瓣红、绿色变化，a*为正值时数值越大，花色越红；色相b*值表示花瓣黄蓝色变化程度；彩度C*表示色彩鲜艳程度，C*值越大，颜色越深；色调角h是对红、橙、黄、绿、青、蓝、紫7种颜色色调描述。进一步的，白色、粉色和红色花瓣L*值的平均值分别为89.46、72.49和56.70，随花色加深L*值降低，花色明亮度降低；白色花瓣a*值介于-0.51—-0.93，平均值为-0.69；粉色花瓣a*值介于31.73—41.71，平均值为36.34；红色花瓣a*值介于48.71—55.91，平均值为52.11；随花色加深a*值升高，花瓣红色程度增加；白色花瓣b*值介于1.65—6.53，平均值为3.97；粉色花瓣b*值介于2.43—9.94，平均值为6.83；红色花瓣b*值介于13.85—21.94，平均值为18.11；随花色加深b*值升高，花瓣红色程度增加；白色、粉色和红色花瓣C*值平均值分别为4.07、35.09和51.69，随花色加深C*值升高，花瓣鲜艳程度增加；白色花瓣h值均处于90°—180°，平均值为98.93；粉色和红色花瓣h值均处于0°—90°，平均值分别为5.43和18.64。山茶品种花色数据如下表：进一步的，提取液中甲醇：水：甲酸：三氟乙酸(TFA)的体积比为70：27：2：1。进一步的，步骤2中根据UPLC–Q–TOF–MS图谱，检测到7种花青苷成分，根据Cy糖苷在513—520nm有特征吸收峰及碎片离子m/z287，推测7种花青苷均为Cy型花青苷。进一步的，峰P1和峰P2质谱数据为分子离子m/z449，碎片离子m/z287(Cy苷元特征质荷比)，根据峰P1和峰P2与标准品Cy3Ga和Cy3G共洗脱特性，及花青素半乳糖洗脱时间小于花青素葡萄糖苷特性；确定峰P1为矢车菊素–3–O–β–半乳糖苷(tR，8.33min)，简称Cy3Ga，确定峰P2为矢车菊素–3–O–β–葡萄糖苷(tR，9.43min)，简称Cy3G；峰P3—峰P7的A440/Avis-max变化范围为32％—33％，确定其为3–O–糖苷类型；峰P3—峰P7在311—316nm波长下肩峰的出现推定化合物被芳香酸酰化；峰P3和峰P4质谱数据为分子离子m/z611，碎片离子m/z449，287；m/z287为Cy苷元特征质荷比，m/z611到m/z449丢失162u，m/z449到m/z287丢失162u，推定其为Cy–3–O–咖啡酰型葡萄糖苷或半乳糖苷；根据山茶中矢车菊素–3–O–[6–O–(E)–咖啡酰]–β–半本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，其特征在于：所述鉴定方法具体如下：步骤1，花色测定：采集山茶品种测定花色的L*、色相a*值、色相b*值、彩度C*值和色调角h，花色测定位置为花瓣上表皮中央部位，光源为C/2°；每样品测量5朵花的花色，数据列表，取平均值；步骤2，定性分析：取山茶品种新鲜花瓣0.6g，液氮研磨至粉末加提取液2mL，浸提24h后用0.22μm滤膜过滤，滤液保存在‑20℃冰箱备用；利用高效液相色谱–光电二极管阵列检测(HPLC–DAD)和超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱(UPLC–Q–TOF–MS)联用技术对花瓣中花青苷成分进行定性分析，联用技术采用超高效液相色谱系统和质谱系统，采用UNIFI1.8软件系统，色谱柱为ACQUITY BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流速：0.3mL·min

【技术特征摘要】
1.一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，其特征在于：所述鉴定方法具体如下：步骤1，花色测定：采集山茶品种测定花色的L*、色相a*值、色相b*值、彩度C*值和色调角h，花色测定位置为花瓣上表皮中央部位，光源为C/2°；每样品测量5朵花的花色，数据列表，取平均值；步骤2，定性分析：取山茶品种新鲜花瓣0.6g，液氮研磨至粉末加提取液2mL，浸提24h后用0.22μm滤膜过滤，滤液保存在-20℃冰箱备用；利用高效液相色谱–光电二极管阵列检测(HPLC–DAD)和超高效液相色谱–四极杆–飞行时间质谱(UPLC–Q–TOF–MS)联用技术对花瓣中花青苷成分进行定性分析，联用技术采用超高效液相色谱系统和质谱系统，采用UNIFI1.8软件系统，色谱柱为ACQUITYBEHC18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流速：0.3mL·min-1，进样量：2μL，柱温40℃；以0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)为流动相，洗脱程序为0—1.5min，5％B；1.5—11min，5％—40％B；11—14min，40％—95％B；14—16.5min，95％B；16.5—16.8min，95％—5％B；16.8—20min，5％B；电喷雾电离离子源(ESI)，正离子模式，全离子扫描，扫描范围(m/z)：50-1200u；脱溶剂气体为高纯度氮气，温度为450℃，流速为600L·h-1，毛细管电压为1kV，锥孔电压为40V；低能量扫描电压为6eV，高能量扫描电压为20—45eV；根据UPLC–Q–TOF–MS图谱，检测到若干种花青苷成分，根据Cy糖苷在513—520nm有特征吸收峰及碎片离子m/z287，推测若干种花青苷均为Cy型花青苷；步骤3，定量分析：运用HPLC–DAD方法，在525nm处检测花瓣中花青苷；采用标准品半定量法分别计算花瓣中含有的相对于标准品矢车菊素–3–O–β–葡萄糖苷(cyanidin-3-O-β-glucoside，Cy3G)的花青苷含量，重复3次。2.根据权利要求1所述的一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，其特征在于：采用分光色差仪对花色测定，CIEL*a*b*体系中，L*表示花色明暗变化程度；色相a*值表示花瓣红、绿色变化，a*为正值时数值越大，花色越红；色相b*值表示花瓣黄蓝色变化程度；彩度C*表示色彩鲜艳程度，C*值越大，颜色越深；色调角h是对红、橙、黄、绿、青、蓝、紫7种颜色色调描述。3.根据权利要求2所述的一种鉴定山茶花色芽变品种的方法，其特征在于：白色、粉色和红色花瓣L*值的平均值分别为89.46、72.49和56.70，随花色加深L*值降低，花色明亮度降低；白色花瓣a*值介于-0.51—-0.93，平均值为-0.69；粉色花瓣a*值介于31.73—41.71，平均值为36.34；红色花瓣a*值介于48.71—55.91，平均值为52.11；随花色加深a*值升高，花瓣红色程度增加；白色花瓣b*值介于1.65—6.53，平均值为3.97；粉色花瓣b*值介于2.43—9.94，平均值为6.83；红色花瓣b*值介于13.85—21.94，平均值为18.11；随花色加深b*值升高，花瓣红色程度增加；白色、粉色和红色花瓣C*值平均值分别为4.07、35.09和51.69，随花色加深C*值升高，花瓣鲜艳程度增加...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辛雷，王洁，殷恒福，范正琪，李纪元，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33