基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置和成像方法制造方法及图纸

一种基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置和成像方法，装置包括多色荧光显微成像系统及单次曝光光谱成像系统，所述的多色荧光显微成像系统包括N台不同波长的激光器、N个二向色滤波片、多通道窄带滤波片、供样品放置的三维纳米平台、显微物镜、二向色片、多通道滤波片和套筒镜头；所述的单次曝光光谱成像系统依次包括空间随机相位调制器、中继放大成像系统和光电探测器。本发明专利技术可单次曝光探测获取生物活细胞超精细结构，成像速度快，对激发光功率密度要求不高，可以应用于活体细胞实时超分辨成像。为生物医学研究提供更加有意义的原始数据。

Microscopic super-resolution imaging device and imaging method based on optical field multi-dimensional information fusion

【技术实现步骤摘要】
基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置和成像方法
本专利技术涉及荧光显微超分辨成像，特别是一种基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置和成像方法。
技术介绍
在光学显微成像中，衍射极限分辨率由显微物镜的数值孔径和入射光波长决定，并且是一个客观存在，无法超越理论极限分辨率。目前显微超分辨技术可分为三类：1、基于单分子定位的稀疏重构技术，代表技术有光激活定位显微(PALM),随机光学重建显微(STORM)和荧光激活定位显微(FPALM)；2、基于点扩展函数工程，是一种扫描成像系统的空域处理技术，代表技术有受激辐射损耗(STED)；3、基于频域处理技术，代表技术有结构光照明显微(SIM)及饱和SIM(SSIM)。目前这三类方法有各自局限，STORM和PALM等宽场成像技术，其定位精度可达20nm，但是重构一幅超分辨率图像需要采集上万张原始图像，成像速度受限，无法应用于活细胞成像。STED技术的分辨率由擦除光功率密度与饱和光功率密度的比值决定，其成像速度取决于扫描速度，与普通的共聚焦显微的成像速度接近，可以应用于小视场的活细胞成像，然而，STED光功率密度相比STORM光功率密度要高4—6个数量级,因此对活细胞的光毒性和光损伤不能忽略,且高功率STED光在实现荧光擦除的同时也加剧了荧光分子的光漂白,这些都限制了STED在活细胞成像中的应用。由于成像原理的限制SIM只能将分辨率提高一倍,即最高100nm左右；SSIM技术可以将分辨率提高到可与STORM/PALM或STED相比拟的几十纳米水平,但饱和激发所需的高功率密度却使其失去了活细胞成像的优势。显微超分辨技术将荧光显微成像的分辨率提高了近一个数量级,其取得的巨大发展为生物医学研究提供了强有力的工具；然而作为一种新兴技术,显微超分辨技术在实际应用于生物医学研究时仍面临着许多亟待解决的问题,尤其是当研究对象是活的、具有一定厚度的、成分和结构复杂的细胞、组织等生物样品时。因此,除了进一步提高分辨率,如何实现显微超分辨的多色成像、厚样品三维成像、活细胞快速成像等也是目前显微超分辨领域的研究重点,这些问题的研究和解决将使显微超分辨技术未来有可能为生物医学研究提供更有意义的活细胞实时超分辨图像和数据。最近将压缩感知理论应用于成像中，可以在信号获取阶段，进行压缩采样，然后利用目标信号的稀疏先验，采用优化算法从压缩采样信号中反演出目标信号。美国Duke大学的Brady小组将压缩感知与光谱成像结合，首次实现了基于幅度掩膜板的准单次曝光压缩光谱成像。它在系统第一成像面处加入二元振幅掩膜板对目标的像进行调制，将调制后的像通过一个分光棱镜后成像于第二成像面上，通过面阵探测器对第二成像面进行探测。在该成像光谱仪中，需要移动振幅掩膜板实现高空间分辨和光谱分辨成像。中科院上海光机所的韩生申研究组提出了基于随机波前相位调制器的压缩光谱成像系统。该系统采用随机波前相位调制器对光场进行随机波前相位调制，它对包含物体二维空间图像信息和一维光谱信息的数据在互不相关的随机测量下进行投影测量，实现压缩采集三维空间图像数据。可以实现单次曝光下获取目标空间光谱三维图像。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出了一种一种基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置和成像方法，该装置可单次曝光探测获取生物活细胞超精细结构，成像速度快，对激发光功率密度要求不高，可以应用于活体细胞实时超分辨成像。为生物医学研究提供更加有意义的原始数据。本专利技术的技术解决方案如下：一种基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置，其特点在于包括多色荧光显微成像系统及单次曝光光谱成像系统，所述的多色荧光显微成像系统包括N台不同波长的激光器、N个二向色滤波片、多通道窄带滤波片、供样品放置的三维纳米平台、显微物镜、二向色片、多通道滤波片和套筒镜头；所述的单次曝光光谱成像系统依次包括空间随机相位调制器、中继放大成像系统和光电探测器；所述的N台激光器各自输出的激光经相应的二向色滤波片反射后融合为一路，经所述的多通道窄带滤波片窄带滤波后经所述的二向色片、显微物镜照射位于所述的三维纳米平台上的样品；该样品激发的多峰荧光和激光经过所述的显微物镜、二向色片、多通道滤波片及套筒透镜后会聚，再依次经所述的空间随机相位调制器、中继放大成像系统后，由所述的光电探测器探测，所述的N为2以上的正整数。所述的显微物镜选择消色差的物镜。所述的随机空间相位调制器是毛玻璃或空间光调制器。所述的中继放大成像系统是各类能将调制荧光信号放大成像到光电探测器感光面上的光学成像系统。所述的光电探测器是各类探测单元随意分布的CCD阵列。利用上述基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置进行成像的方法，包括如下三个阶段：1)第一阶段，标定阶段，具体步骤如下：①将第一荧光小球放置在所述的三维纳米平台上，打开与第一荧光小球激发谱对应波长的激光器，激光器输出光依次经过二向色滤波片、多通道窄带滤波片、二向色片和显微物镜入射到放置有荧光小球的三维纳米平移台上，激发荧光小球发射荧光信号；所述的荧光信号依次经过所述的显微物镜、二向色片、多通道滤波片、套筒透镜、空间随机相位调制器和中继放大成像系统，形成散斑信号Ir(r,λ)，被所述的光电探测器探测记录；②控制所述的三维纳米平台，使荧光小球在空间位置上等间距地移动，并记录对应空间位置处的散斑信号Ir(ri,λ),i＝1,…,n,其中n为对应三维空间标定点的数目，ri为荧光小球的空间位置，λ为荧光小球的发射波长；完成空间维度的标定，得到第一组散斑图像；③替换第一荧光小球，将第二荧光小球放置在三维纳米平台上，打开与第二荧光小球激发谱对应波长的激光器，重复前一个波长标定过程，记录此发射波长的对应的系统响应信号，完成该波长的标定，得到第二组散斑图像；④依次类推，完成第N个荧光小球的波长的标定，得到第N组散斑图像；⑤所述的第一荧光小球、第二荧光小球、…、和第N荧光小球的材料不同，吸收光谱不同，发射光谱也不同；2)第二阶段，成像阶段，具体步骤如下：①将多色染料标记的生物样品放置在所述的三维纳米平台上，打开与荧光染料分子对应激发谱的多波长激光器，激光器输出光依次经过二向色滤波片、多通道窄带滤波片、二向色片和显微物镜入射到位于所述的三维纳米平台上的多色染料标记的生物样品的表面，激发该多色染料标记的生物样品发射荧光信号；②所述的生物样品发射的荧光信号依次经过所述的显微物镜、二向色片、多通道滤波片、套筒透镜、空间随机相位调制器和中继放大成像系统，形成散斑信号It，被所述的光电探测器探测记录，完成对多色染料标记的生物样品成像；3)第三阶段，图像反演阶段，具体步骤如下：按照标定点源空间位置和光谱顺序，将每一组散斑图像拉成一列，作为构建系统测量矩阵A的一列，将所述的散斑信号It拉成一列作为测量信号y，反演得到生物样品的图像x，公式如下：其中，||·||1,||·||2分别为l1范数和l2范数，xj为图像x的第j个像素强度值，α,β为权重系数。本专利技术利用多色荧光分子(多色染料分子或多色量子点)在空间位置随机地对生物样品进行标记，使得相邻荧光分子的光谱存在差异性。采用多波长激光器对多色荧光样品进行激发，采用多通道滤波片滤除荧光信号中的激光背景信号。空间随机相位调制器(毛玻璃或空间光调制器)实现对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置，其特征在于包括多色荧光显微成像系统及单次曝光光谱成像系统，所述的多色荧光显微成像系统包括N台不同波长的激光器(1)、N个二向色滤波片(2)、多通道窄带滤波片(3)、供样品放置的三维纳米平台(4)，显微物镜(5)、二向色片(6)、多通道滤波片(7)和套筒镜头(8)；所述的单次曝光光谱成像系统依次包括空间随机相位调制器(9)、中继放大成像系统(10)和光电探测器(11)；所述的N台激光器(1)输出的激光经相应的二向色滤波片(2)反射后融合为一路，经所述的多通道窄带滤波片(3)窄带滤波后经所述的二向色片(6)、显微物镜(5)照射位于所述的三维纳米平台(4)上的样品；该样品激发的多峰荧光和激光经过所述的显微物镜(5)、二向色片(6)、多通道滤波片(7)及套筒透镜(8)后会聚，再依次经所述的空间随机相位调制器(9)、中继放大成像系统(10)后，由所述的光电探测器(11)探测，所述的N为2以上的正整数。

【技术特征摘要】
1.一种基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置，其特征在于包括多色荧光显微成像系统及单次曝光光谱成像系统，所述的多色荧光显微成像系统包括N台不同波长的激光器(1)、N个二向色滤波片(2)、多通道窄带滤波片(3)、供样品放置的三维纳米平台(4)，显微物镜(5)、二向色片(6)、多通道滤波片(7)和套筒镜头(8)；所述的单次曝光光谱成像系统依次包括空间随机相位调制器(9)、中继放大成像系统(10)和光电探测器(11)；所述的N台激光器(1)输出的激光经相应的二向色滤波片(2)反射后融合为一路，经所述的多通道窄带滤波片(3)窄带滤波后经所述的二向色片(6)、显微物镜(5)照射位于所述的三维纳米平台(4)上的样品；该样品激发的多峰荧光和激光经过所述的显微物镜(5)、二向色片(6)、多通道滤波片(7)及套筒透镜(8)后会聚，再依次经所述的空间随机相位调制器(9)、中继放大成像系统(10)后，由所述的光电探测器(11)探测，所述的N为2以上的正整数。2.根据权利要求1所述的基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置，其特征在于，所述的显微物镜选择消色差的物镜。3.根据权利要求1所述的基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置，其特征在于，所述的随机空间相位调制器是毛玻璃或空间光调制器。4.根据权利要求1所述的基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置，其特征在于，所述的中继放大成像系统是各类能将调制荧光信号放大成像到光电探测器感光面上的光学成像系统。5.根据权利要求1所述的基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置，其特征在于，所述的光电探测器(11)是各类探测单元随意分布的CCD阵列。6.利用权利要求1至5任一项所述的基于光场多维信息融合显微超分辨成像装置进行成像的方法，其特征在于，该方法包括如下三个阶段：1)第一阶段，标定阶段，具体步骤如下：①将第一荧光小球放置在所述的三维纳米平台(4)上，打开与第一荧光小球激发谱对应波长的激光器(1)，激光器输出光依次经过二向色滤波片(2)、多通道窄带滤波片(3)、二向色片(6)和显微物镜(5)入射到放置有荧光小球的三维纳米平移台(4)上...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩申生，童智申，刘震涛，胡晨昱，刘盛盈，
申请(专利权)人：中国科学院上海光学精密机械研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31