miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用制造技术

研究指出miR‑26b参与了动物的繁殖调控，miR‑26b可通过靶向Smad4基因调控猪卵巢颗粒细胞凋亡，miR‑26a也可能有类似功能，但miR‑26a在生殖细胞中的研究还未见相关报道。本发明专利技术公开了miR‑26a调节生殖细胞凋亡的应用。本发明专利技术公开了DHCR24和Smad4是miR‑26a的靶基因，在猪卵巢颗粒细胞中，miR‑26a在转录水平和翻译水平负调控DHCR24和Smad4的表达；miR‑26a通过干扰DHCR24和Smad4表达从而促进卵巢颗粒细胞凋亡，同时再通过调节类固醇合成通路影响激素分泌控制雌二醇、孕酮分泌。

Application of microRNA-26a in regulating apoptosis of germ cells

【技术实现步骤摘要】
miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用
本专利技术涉及细胞工程和基因工程
，尤其涉及一种miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用。
技术介绍
在哺乳动物卵巢中，卵泡发生和闭锁过程受到复杂的基因网络的严格调控。因此，可以同时来源于细胞和细胞外来源的miRNA通过广泛参与转录后的mRNA调节而起到介导这些过程的作用。已有研究表明，卵巢miRNA在卵泡和黄体发育、卵巢功能和卵巢疾病和内分泌紊乱方面起着重要作用，miRNA通过促进颗粒细胞凋亡和抑制凋亡来发挥调控作用。据报道，miR-26b参与了动物繁殖的调控，miR-26b通过靶向Smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡，miR-26a与miR-26b具有相同的种子序列，因此，miR-26a可能在卵巢颗粒细胞中也发挥相似作用。有学者通过分析miRNA在卵泡发育过程中表达模式，筛选和鉴定相关miRNA、mRNA和通路，发现Smad2是调节牛卵泡发育的中枢因子，并且进一步研究发现miR-26a/b调控Smad2基因发挥作用。这些研究结果表明，miR-26a在卵泡发育过程中可能起着重要的调控作用，但目前miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的研究还未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术提出一种miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用。优选地，miR-26a的核酸序列如SEQ.NO.1所示。优选地，生殖细胞为哺乳动物的生殖细胞；优选地，生殖细胞为猪的生殖细胞；优选地，生殖细胞为卵巢颗粒细胞。优选地，miR-26a调控Seladin-1基因的表达来调节生殖细胞凋亡；优选地，miR-26a调控2,4-脱氢胆固醇还原酶来调节生殖细胞凋亡。优选地，miR-26a调控Smad4基因的表达来调节生殖细胞凋亡。Seladin-1基因与编码DHCR24酶的基因是一样的，后统一命名为2,4-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24，又称Seladin-1)。DHCR24蛋白的抗凋亡作用与抑制Caspase-3的激活有关，如神经细胞和其他细胞模型所示。进一步的研究表明，DHCR24具有清除剂活性，从而保护细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡，即DHCR24具有活性氧清除活性。这些研究表明，DHCR24对许多细胞类型具有抗凋亡活性。因此，DHCR24是一种同时具有胆固醇合成和抗凋亡活性的多功能蛋白。虽然已有研究表明，DHCR24在卵巢中有表达，但在卵泡发育及颗粒细胞功能调控方面研究还尚不清楚。而刘吉英(刘吉英.miR-26b调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制[D].南京农业大学,2016)揭露了miR-26b通过靶向Smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡，而miR-26a与miR-26b具有相同的种子序列，即miR-26a可能在卵巢颗粒细胞中也发挥相似作用，但相关研究还较少，目前miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的研究还未见相关报道。本专利技术公开了DHCR24和Smad4是miR-26a的靶基因，在猪卵巢颗粒细胞中，miR-26a在转录水平和翻译水平负调控DHCR24和Smad的表达；miR-26a通过干扰DHCR24和Smad4表达从而促进卵巢颗粒细胞凋亡，同时再通过调节类固醇合成通路影响激素分泌控制雌二醇、孕酮分泌。附图说明图1为双荧光素酶报告检测中GP-miRGLO质粒图谱信息。图2为miR-26a与DHCR24的3’UTR区域结合图。图3为miR-26a与Smad4的3’UTR区域结合图。图4为qPCR检测miR-26a小片段转染效率图。图5为miR-26a促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。图6为miR-26a对雌二醇、孕酮分泌的影响图。图7为Smad4-WT比对结果图。图8为Smad4-MUT比对结果图。图9为DHCR24-WT比对结果图。图10为DHCR24-MUT比对结果图。图11为实施例6的双荧光素酶活性检测图。图12为qPCR验证miR-26a转录水平调控靶基因表达图。图13为WesternBlot验证miR-26a对靶基因蛋白水平的影响图。图14为qPCR检测si-DHCR24、si-Smad4干扰效率图。图15为干扰DHCR24对颗粒细胞凋亡的影响图。图16为干扰Smad4对颗粒细胞凋亡的影响图。图17为干扰靶基因对雌二醇、孕酮的影响图。具体实施方式miR-26a模拟物(miR-26amimic)、模拟物阴性对照(mimicNC)、miR-26a抑制物(miR-26ainhibitor)、抑制物阴性对照(inhibitorNC)、Smad4干扰RNA(si-Smad4)、DHCR24干扰RNA(si-DHCR24)干扰RNA阴性对照(NC-siRNA)均由广州市锐博科技生物有限公司合成，核酸序列如下：注：DHCR24-siRNA序列为靶序列；NC-siRNA由广州锐博科技生物有限公司合成，其序列保密。实施例1生物信息学预测及保守性分析在miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)下载猪(Susscrofa)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、牛(Bostaurus)、山羊(Caprahircus)、猴(Macacamulatta)、马(Equuscaballus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、斑马鱼(Daniorerio)、鸡(Gallusgallus)10个物种的miR-26a成熟序列，使用MEGA6.0软件分析其保守性。不同物种中miR-26a成熟序列比对如下表所示(其下表中虚线框内为种子序列)：由上表可知：miR-26a的成熟序列在哺乳动物及斑马鱼中序列完全一致，具有22个碱基，鸡仅仅5‘端少一个碱基U，表明miR-26a在脊椎动物中具有较高的保守性。根据NCBI数据库查询猪DHCR24、Smad4mRNA序列信息，其3’UTR长度分别为2649bp、1315bp。根据本申请人前期对猪卵泡期和黄体期卵巢进行转录组及miRNA测序分析(详见田密.约克夏猪卵巢黄体期到卵泡期转变的关键miRNA的筛选与功能分析[D].安徽农业大学,2018；张旭.猪卵巢卵泡期和黄体期的转录组特征及差异基因筛选[D].安徽农业大学,2018)，以及对猪高低产仔猪卵巢转录组及小RNA高通量测序分析(详见黄龙.基于卵巢RNA组学鉴定影响猪产仔数性状的候选基因及microRNA[D].安徽农业大学,2016.)，发现miR-26a可能与DHCR24、Smad4存在靶向关系。通过RNAhybird(bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)预测可知，DHCR24和Smad4可能是miR-26a调控的基因，预测结果如图2和图3，图2为miR-26a与DHCR24的3’UTR区域结合图，图3为miR-26a与Smad4的3’UTR区域结合图。实施例2引物设计与合成从最新的miRBase22.1数据库(www.mirbase.org)中查询并下载ssc-miR-26a(序列号：MI0002429)的成熟序列。利用加尾法设计miRNA引物，下游引物为通用引物由TipGreenmiRNATwo-StepqRT-PCRSuperMix试剂盒提供。从NCBI数据库，下载猪基因Smad4(GeneID：397142)、DHCR24(GeneI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR‑26a调节生殖细胞凋亡的应用。

【技术特征摘要】
1.miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，miR-26a的核酸序列如SEQ.NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，生殖细胞为哺乳动物的生殖细胞。4.根据权利要求1-3任一项所述应用，其特征在于，生殖细胞为猪的生殖细胞。5.根据权利要求1-4任一项所述应用，其特征在于，生殖细胞为卵巢颗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓东，殷宗俊，丁月云，尚金男，陶强强，章会斌，徐怡亮，陈一歌，朱卫华，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34