大麦耐湿调控基因HvERF2.11、蛋白及其在育种中的应用制造技术

本发明专利技术公开了大麦耐湿调控基因HvERF2.11、蛋白及其在育种中的应用。大麦耐湿基因HvERF2.11的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术首次从耐湿大麦中克隆得到耐湿基因HvERF2.11，并证明该基因与大麦耐湿性有关，采用基因工程的方法，将HvERF2.11基因过表达到拟南芥中，与对照组相比，转基因植株耐湿能力显著增强，说明HvERF2.11基因的过表达提高了植株的耐湿性。本发明专利技术中HvERF2.11基因的克隆与转化、转基因等技术为研究大麦耐湿的分子机理及育种应用奠定了基础，具有广阔的育种应用前景和一定的经济价值。

HvERF2.11, Protein and Its Application in Breeding of Barley

【技术实现步骤摘要】
大麦耐湿调控基因HvERF2.11、蛋白及其在育种中的应用
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一个大麦耐湿调控基因HvERF2.11及其育种应用。
技术介绍
湿害（waterlogging）是指土壤水分过多造成的缺氧环境，对作物正常生长发育所产生的危害。湿害在世界各地均有发生，尤其在北美、澳大利亚、中国、印度等国较为严重。随着全球生态环境的恶化，极端天气出现的频率不断增加，旱涝灾害发生频繁，湿害已经成为影响农作物生产的主要非生物胁迫因素之一。据统计，在世界范围内，大约有16%耕地均受到不同程度的湿涝危害，湿害往往导致作物减产约20%-30%，严重的湿害甚至导致绝收。我国是世界上受湿涝影响较为严重的国家之一，每年大约有30%的耕地面积受到不同程度洪涝影响，且呈逐年增加的趋势。仅在2013年，我国因为洪涝造成农田受灾面积达1.19×107hm2，造成了3000亿元以上的直接经济损失。植物在长期进化过程中形成了多个基因协同表达调控模式，以适应逆境胁迫。近年来，对植物响应逆境胁迫研究已从单个功能基因的克隆及功能鉴定转向对转录因子的鉴定及调控功能研究。一个与逆境胁迫相关的转录因子，可同时调控下游一系列相关功能基因的表达变化。因此，转录因子对作物抗逆性改良的效果可能比单个功能基因更好。水稻、拟南芥、猕猴桃等植物中克隆的耐湿调控基因均属于转录因子ERF-VIIs亚族基因，目前大麦中作为转录因子的耐湿调控基因尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个大麦耐湿基因HvERF2.11及其育种应用，克隆并构建HvERF2.11基因表达载体，利用转基因技术将HvERF2.11基因导入拟南芥，对转基因拟南芥进行湿害胁迫处理，确认HvERF2.11具有耐湿活性，为大麦耐湿品种改良提供基因资源及理论依据。通过生物信息学分析，我们在大麦中鉴定到54个属于ERF基因家族；系统进化树分析发现HvERF2.11与拟南芥中低氧胁迫相关基因HRE1、HRE2、RAP2.12及RAP2.2进化关系最近。通过qRT-PCR技术分析大麦不同器官、不同条件下HvERF2.11基因表达水平，克隆了耐湿大麦TF58中HvERF2.11基因，并将HvERF2.11基因转入拟南芥，验证了该基因的功能，以期为大麦品种耐性分子标记辅助选择育种奠定基础。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种大麦耐湿调控相关蛋白，所述的蛋白为如下（a）或（b）：（a）由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；具体序列为MCGGAILAGFIPPSAAAAAAKAAATAKKKQQQRSVTADSLWTGLRKKADEEDFEADFRDFERDSSEEEDDEVEEVPPPPAPATAGFAFAAAAEVALRAPARRDAAVQHDGPAAKQVKRVRKNQYRGIRQRPWGKWAAEIRDPSKGVRVWLGTYDTAEEAARAYDAEARKIRGKKAKVNFPEDAPTVQKSTLKPTAAKSAKLAPPPKACEDQPFNHLSRGDNDLFAMFAFSDKKVPAKPTDSVDSLLPVKHLAPTEAFGMNMLSDQSSNSFGSTDFGWDDEAMTPDYTSVFVPSAAAMPAYGEPAYLQGGAPKRMRNNFGVAVLPQGNGAQDIPAFDNEVKYSLPYVESSSDGSMDNLLLNGAMQDGASSGDLWSLDELFMAAGGY；（b）将SEQIDNO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大麦耐湿调控相关的由SEQIDNO:2衍生的蛋白质。本专利技术还提供编码前述蛋白的基因。所述基因是如下（a1）-（a3）中任何一种的DNA分子；（a1）SEQIDNO:1所示的DNA分子；（a2）在严格条件下与（a1）限定的DNA序列杂交且编码大麦耐湿调控相关蛋白的DNA分子；（a3）与（a1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或者至少具有99%同源性且编码大麦耐湿调控相关蛋白的DNA分子。本专利技术还提供含有前述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。本专利技术的另一个目的是提供（b1）或（b2）或（b3）的应用：（b1）所述蛋白，或，所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗大麦湿害胁迫中的应用；（b2）所述蛋白，或，所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育大麦、拟南芥耐湿新品种中的应用；（b3）所述蛋白，或，所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗拟南芥湿害胁迫中的应用。本专利技术还提供一种培育植物耐湿品种的方法，将所述的基因转入目的植物，或所述的表达盒、重组载体转化目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物的湿害胁迫抗性高于所述目的植物。所述目的植物为大麦、拟南芥。所述的转基因植物表达所述的大麦耐湿相关蛋白。HvERF2.11基因所述DNA片段如序列表SEQIDNO.1所示，或者基本相当于SEQIDNO.1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQIDNO.1所示序列的部分片段。对该基因进行序列分析，表明HvERF2.11基因编码区全长为1158bp、编码385个氨基酸，分子量为41.38kDa、等电点为5.14，含有保守的AP2结构域。超表达序列表SEQIDNO.1所示序列可以增强拟南芥和大麦等植物对湿害的耐性。上述基因可以应用于改良大麦的耐湿能力，具体操作如下：（1）基因的获得：通过生物信息学分析，获得大麦中HvERF2.11基因的全长基因序列，提取耐湿品系TF58根系总RNA，利用RT-PCR扩增到HvERF2.11的基因序列，将扩增产物连接到pGEM-Teasy载体上，经测序获得具有HvERF2.11基因的克隆。（2）植物表达载体构建与遗传转化：利用Invitrogen公司的Gateway技术构建大麦HvERF2.11基因超表达载体。利用BPClonase™enzyme，将HvERF2.11基因与pDONR221载体连接，构建入门载体，然后利用LRClonase™enzyme，将入门载体与pB2GW7载体连接，构建含有HvERF2.11基因的超表达载体。通过液氮冻融法将含有HvERF2.11基因的超表达载体导入农杆菌Gv3101中。利用农杆菌介导的遗传转化法，将HvERF2.11编码序列导入拟南芥中表达。通过抗生素筛选、RT-PCR等筛选阳性转基因拟南芥植株。（3）转基因植株耐湿性分析：将正常生长35天的转基因和野生型拟南芥株系进行淹水处理。淹水处理2周后，观察湿害胁迫下转基因植株与野生型植株的表型差异，从而证明HvERF2.11基因对改良拟南芥耐湿性的能力。本专利技术为增强植物对湿害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段改良作物的耐湿性，不仅克服传统育种周期短，而且操作简单、容易获得耐湿性材料。本专利技术首次克隆得到了大麦耐湿调控基因HvERF2.11，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥中，经过湿害鉴定分析，证明转基因植株较野生型植株的耐湿能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大麦耐湿调控相关蛋白，其特征在于，所述的蛋白为如下（a）或（b）：（a）由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将SEQ ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大麦耐湿调控相关的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种大麦耐湿调控相关蛋白，其特征在于，所述的蛋白为如下（a）或（b）：（a）由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将SEQIDNO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大麦耐湿调控相关的由SEQIDNO:2衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下（a1）-（a3）中任何一种的DNA分子；（a1）SEQIDNO:1所示的DNA分子；（a2）在严格条件下与（a1）限定的DNA序列杂交且编码大麦耐湿调控蛋白的DNA分子；（a3）与（a1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或者至少具有99%同源性且编码大麦耐湿调控蛋白的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。5.（b1）或（b2）或（b3）的应用：（b1）...

【专利技术属性】
技术研发人员：栾海业，许如根，吕超，郭宝健，王菲菲，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32