细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用，所述细胞膜定位罗布麻蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术首次鉴定得到罗布麻AvCESA1基因，并证实AvCESA1蛋白定位在质膜上，构建的融合表达载体可做为其它蛋白质膜定位的标记，以此实现的质膜定位法适用性强，容易操作，试验周期相对较短，且灵敏度高，可实现高通量的蛋白质亚细胞定位。

Cell Membrane Localization of Apocynum venetum Protein and Its Encoding Sequence, Fusion Expression Vector and Application

【技术实现步骤摘要】
细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用。
技术介绍
蛋白质是一种生命大分子，结构复杂多样功能各异，在几乎所有的生命活动中起着非常重要的作用。生命活动的基本单位是细胞。原生质体和细胞壁是构成植物细胞的两个主要部分组成。原生质体主要由细胞核和细胞质组成，是细胞壁内一切物质的总称。细胞质和细胞核中还有类型各异的的细胞器，例如高尔基体、线粒体、内质网、过氧化物酶体、核糖体、叶绿体、溶酶体以及液泡等。而亚细胞结构就是指这些包括细胞壁和质膜在内的不同细胞器。亚细胞结构中都散布各种类型的蛋白质。通常膜系统包括质膜以及各种细胞器内膜是蛋白质种类最为丰富的区域。在膜系统上分布的蛋白质主要有通道蛋白、与细胞活动相关的离子泵、载体蛋白受体蛋白以及合成酶等。不同的亚细胞结构行使不同的功能，招募特定的蛋白质完成生命活动。同时各类亚细胞结构具有各自独特的物理空间和化学性质如pH值，能够为蛋白质参与生命体的各种活动提供稳定的环境和条件。研究蛋白质的亚细胞定位信息能够起到如下作用：（1）有利于推断蛋白质的功能。知道了蛋白质所处的亚细胞位置，便能够对蛋白质的功能、进化、与其它蛋白质之间的相互作用进行推断，初步明确蛋白质可能的功能作用；（2）了解基因功能表达的信息。生命体的核心物质是基因，基因通过一系列的生物作用生成蛋白质。生命体中基因所蕴含的遗传密码均是通过蛋白质来向生命体传达蛋白质的亚细胞定位信息可以为各种生命活动发生的机理提供理论依据。因此蛋白质亚细胞定位的研究具有重要价值和实际意义。目前，植物蛋白质亚细胞定位方法主要包括:（1）免疫组织化学定位法；（2）共分离标记酶辅助定位法；（3）蛋白质组学定位技术；（4）生物信息学预测方法和（5）融合报告基因定位法。免疫组织化学定位法一般需要结合切片技术、免疫杂交技术和显微镜技术对蛋白质亚细胞定位做出验证。具体做法为将目标材料进行切片制作，然后利用特异性抗体与切片中的目标蛋白进行杂交，最后借助显微镜观察抗体携带的荧光标记所在的位置，确定目标蛋白的亚细胞定位。该方法最大的特点是能够反映生物活体状态下蛋白的真实定位，可以在亚细胞水平检测多种抗原物质，比如激素、多肽以及受体等，反应灵敏。但是该方法也存在显著的缺点，并非所有的目的蛋白都能够找到合适的特异性抗体，并且操作繁琐，技术要求高。。共分离标记酶辅助定位法首先需要超速离心分离细胞组分，然后通过检测特定细胞器具有的特征蛋白酶活性确定具体的亚细胞结构，再利用目标蛋白的特异性抗体进行杂交，进而确定目标蛋白的有无和亚细胞位置。同免疫组织化学定位法一样，该方法的不足也在于需要目的蛋白的特异性抗体，并且并非所有的细胞器都有特征酶，因此其应用也受到限制。蛋白质组学定位技术结合细胞器组分分离技术、双向电泳技术和质谱技术实现蛋白质亚细胞定位的高通量研究。同过细胞器组分分离明确亚细胞结构，双向电泳实现各种蛋白质的分离，质谱分析确定蛋白种类。但高丰度蛋白对双向电泳结果的遮蔽作用以及细胞组分分离的混杂会对质谱检测的高灵敏度结果形成误导，影响结果的准确性。目前，随着基因组和蛋白组等组学技术以及生物信息学的发展，通过生物信息学手段对大数据进行整合分析的蛋白质亚细胞定位预测成为该领域的一个便捷手段。其原理在于对目前已知亚细胞定位的各类蛋白质进行氨基酸特征序列提取或描述，同过对未知定位蛋白的相关参数进行解析和比对进行亚细胞定位预测。该方法能够实现高通量预测，并且能够见底成本提高时效性，但大多数的预测程序都有局限性，其预测结果往往还需要实验验证。而融合报告基因定位法则是利用分子生物学手段，将编码目的蛋白的基因与报告基因（目前所用多为GUS和荧光蛋白基因，如GFP/RFP）进行融合，构建表达载体，然后通过观察报告基因产物所在的亚细胞位置确定目的蛋白的亚细胞定位。该方法操作简便，适用性强，且实验周期短结果可靠是目前进行蛋白质亚细胞定位的首选方法。有实验证实，很多蛋白质可以在不同细胞器之间穿梭实现生物学功能，这类蛋白质被称为多标记蛋白。而有一些蛋白质只在单一细胞器上发挥作用，其位置固定，可以通过与荧光蛋白构建融合表达蛋白，做为一种工具蛋白，利用融合报告基因定位法来指示其它蛋白质的亚细胞位置。纤维素合成酶基因编码的纤维素合成酶蛋白就是一种定位在质膜上的蛋白质，能够在质膜上合成纤维素。拟南芥CESA蛋白在N端有一个保守的锌指蛋白结构域，包含“CXXC”氨基酸残基序列，长度在10~40个氨基酸残基左右，形成CX2CX12FXACX2PXCX2CXEX5GX3CX2C保守域。该保守域能在CESA蛋白形成蛋白复合体时进行蛋白之间的相互识别，形成一个由6个CESA蛋白组合而成的蛋白复合体合成纤维素单元。而在拟南芥CESA蛋白的C端则具有6个相对保守的跨膜区，锚住质膜定位与细胞质膜上。但是根据CESA蛋白定位于质膜特性开发的膜定位荧光蛋白标记载体没有报道。因此，现有技术还有待进一步发展。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术实施例提供了一种细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用。本专利技术的技术方案如下：一种细胞膜定位罗布麻蛋白，其中，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的细胞膜定位罗布麻蛋白，其中，其氨基酸序列具有8个跨膜区，分别在N端有两个连续跨膜区，位于289-311和318-337氨基酸位置；在C端有6个连续跨膜区位于876-898，910-932，947-969，994-1016，1026-1048和1061-1081氨基酸位置。一种如上所述细胞膜定位罗布麻蛋白的编码序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一种融合表达载体，其中，利用如权利要求3所述的编码序列构建。所述的融合表达载体，其中，利用Pcam35tlerfps2#4-RFP载体和罗布麻蛋白编码序列构建融合表达载体。所述的融合表达载体，其中，以罗布麻cDNA为模板高保真酶Pfu进行全长扩增；载体Pcam35tlerfps2#4-RFP经XbaI单酶切后获得线性化载体；罗布麻蛋白的编码序列全长片段和线性化载体根据PCR产物回收试剂盒EasyPurePCRPurificationKit的步骤分别进行回收。一种细胞膜定位罗布麻蛋白的应用，其中，所述应用为利用细胞膜定位罗布麻蛋白定位到细胞膜的应用。所述的细胞膜定位罗布麻蛋白的应用，其中，利用如上所述的融合表达载体表达的融合蛋白作为细胞膜定位的标记。有益效果本专利技术提供一种细胞膜定位罗布麻蛋白及编码序列及融合表达载体和应用，本专利技术首次鉴定得到罗布麻AvCESA1基因，并证实AvCESA1蛋白定位在质膜上，构建的融合表达载体可做为其它蛋白质膜定位的标记，以此实现的质膜定位法适用性强，容易操作，试验周期相对较短，且灵敏度高，可实现高通量的蛋白质亚细胞定位。附图说明图1为罗布麻AvCESA1基因同源克隆产物片段，其中，泳道1为2kbMarker，泳道2和3均为同源片段产物。图2为罗布麻AvCESA1基因5’序列，其中，泳道1为2kbMarker，泳道2和3均为扩增的5’序列。图3为罗布麻AvCESA1基因3’序列，其中，泳道1为2kbMarker，泳道本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞膜定位罗布麻蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种细胞膜定位罗布麻蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的细胞膜定位罗布麻蛋白，其特征在于，其氨基酸序列具有8个跨膜区，分别在N端有两个连续跨膜区，位于289-311和318-337氨基酸位置；在C端有6个连续跨膜区位于876-898，910-932，947-969，994-1016，1026-1048和1061-1081氨基酸位置。3.一种如权利要求1或2所述细胞膜定位罗布麻蛋白的编码序列，其特征在于，其核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐宗昌，李义强，张成省，任婷婷，杜海娜，王萌，荆常亮，袁源，孟晨，马斯琦，尤祥伟，赵栋霖，邹平，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37