抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用。抗菌肽YD为2017年报道的从解淀粉芽孢杆菌CBS抗菌肽YD1中分离纯化抗菌肽（APKGVQGPNG），体外实验证明具有抗菌活性和抗氧化活性。本发明专利技术通过抗菌肽YD作用于两种细胞模型（人肝星状细胞（LX‑2）模型和脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型）和体内肝纤维化小鼠模型，证明抗菌肽YD通过抑制炎症反应进而阻碍肝脏纤维化的发生发展，具有抗肝脏纤维化的作用，并且细胞毒性低，因此，可以抗菌肽YD为活性成分，采用药剂学上常规工艺和辅料，制备成各种剂型的抗肝脏纤维化药物，具有很好的医药应用前景。

Application of Antimicrobial Peptide YD in the Preparation of Drugs for the Treatment of Liver Fibrosis

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种具有抗菌作用多肽的新的医药用途，具体涉及抗菌多肽抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用。
技术介绍
肝纤维化是一个由各种致病因子共同参与的复杂的生理病理过程，涉及到多种细胞、细胞因子、信号转导通路等，病理表现主要为肝细胞外基质(extracellularmatrixc，ECM)合成和降解失衡，造成细胞外基质在肝脏中沉积，引起肝脏结构变化并影响肝功能。如不及时治疗，纤维化的过程长期持续就会发展成为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。肝纤维化是各种慢性肝脏疾病的共同病理过程。慢性肝病是全球发病率和死亡率的主要原因，每10万人中有360人受慢性肝病影响，在总死亡率中居第12位(JMagnResonImaging.2017,45:1276-1295)。肝纤维化是各种慢性肝病发展成肝硬化的早期可逆阶段，应尽可能在此阶段或者肝硬化早期进行肝纤维化的逆转，防止向肝硬化晚期及肝癌的发展。目前防治肝纤维的策略主要有：去除肝病的病因、减轻炎症和氧化应激、保护肝细胞不受损伤；抑制肝星状细胞的激活、活化；诱导活化肝星状细胞凋亡；抑制ECM合成，促进ECM降解等。临床上主要用于缓解肝纤维化的药物有水飞蓟宾、甘草次酸、吡非尼酮、糖皮质醇等，但由于这些药物导致的副作用发生较为频繁，抗纤维化作用机制尚不明确，所以这些药物在临床应用中很受限制，因此开发安全有效的新型抗肝纤维化药物具有重要的临床意义(Seminarsinliverdisease2016;36:87-98)。多肽药物因为其适应症广泛且疗效显著、安全性高、体内不易产生蓄积，与其他药物的相互作用比较小等优点受到众多研究人员的关注。在新药研发、生产、使用过程中独具特色,已成为当前国际新药研发的重要方向之一。目前还没有多肽药物直接以抗肝纤维化为适应证进入临床研究。抗菌肽是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分，具有趋化作用、促进生长、伤口愈合等免疫调节和抗炎活性。抗菌肽YD是JinCheolYoo等人于2017年从解淀粉芽孢杆菌CBS抗菌肽YD1中分离纯化得到由10个氨基酸组成的多肽，序列信息为APKGVQGPNG，抗菌肽YD对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌活性且具有非常好的热稳定性，酸碱稳定性和酶解稳定性，在脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)模型中展示了很好的抗氧化作用(AMBExpress.2017,7:8;FoodChem.2018,239:502-510)。但是抗菌肽YD在治疗肝纤维化方面的作用至今还没有报道。本专利技术建立了四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型和脂多糖诱导的RAW264.7炎症细胞模型，说明抗菌肽YD能够通过介导抗炎活性从而逆转肝纤维化的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗菌肽YD的医药新用途，即在治疗肝脏纤维化药物中的应用。本专利技术采用的技术方案如下：抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用；其以抗菌肽YD为活性成分，采用药剂学常规工艺和辅料，制备成各种剂型的抗肝脏纤维化药物。本专利技术所述的抗肝脏纤维化药物的剂型为肌肉注射剂或口服剂。本专利技术所述的抗菌肽YD是通过采用经典的“Fmoc”保护策略的固相多肽合成法合成。本专利技术通过动物实验与细胞实验，在细胞和分子水平分别通过一系列实验证实了抗菌肽YD在治疗肝脏纤维化中的药理学活性：一、动物实验1.小鼠建模与给药用四氯化碳（CCl4）诱导构建小鼠肝纤维化模型：SPF级别健康雄性C57BL/6小鼠，体重18-20g，由兰州大学实验动物中心（GLP）提供，整个实验过程的执行均受到兰州大学实验动物伦理委员会的许可与监督（动物操作许可证文号：SYXKGan2013-0003）。动物适应性饲养1周后，随机分为两组，即空白组与模型组：模型组，剂量为0.5mL/100g体质量，腹腔注射20%CCL4玉米油溶液诱导肝纤维化模型,每周两次；空白组小鼠，予腹腔注射等量玉米油溶液。所有小鼠均以普通饲料喂养及自由饮水，共造模6周。造模后空白对照组与模型组、抗菌肽组均予标准小鼠基础饲料喂养。除空白组外，各组于造模开始后第3周开始每天进行腹腔注射给药治疗。按《动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表》计算出小鼠模型实验所需用药剂量：空白对照组和模型对照组腹腔注射生理盐水；抗菌肽组腹腔注射抗菌肽YD（500μg/kg），至第6周末结束。给药结束后禁食过夜，次日称重麻醉，眼球静脉取血，以3000r/min离心10min，收集血清，置于-80℃冰箱储存待测相关血清学指标。肝组织以预冷的生理盐水冲洗后分叶：置入4%多聚甲醛中固定以待制备石蜡切片，剩余肝组织液氮速冻分装入冻存管，于-80℃冰箱保存备用。2.小鼠肝脏组织病理切片肝组织用4%多聚甲醛在4℃固定24h后，依次使用70%、80%、90%、95%和100%的乙醇脱水。接着采用二甲苯溶液处理30min并重复1次后，放入55-65℃已溶化的石蜡内浸渍40min，重复1次，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。包埋后在切片机上切成蜡片，于40℃的水面进行展平，展平后放置在清洁的载玻片上，置于60℃烤箱中烘烤。制片后分别进行HE与天狼星红染色。3.肝组织石蜡切片HE染色石蜡切片65℃烘干1h,进行HE染色。染色流程：二甲苯（I）20min,二甲苯（II）20min，无水乙醇（I）15min,无水乙醇（II）15min，95%乙醇10min,90%乙醇5min,80%乙醇5min,苏木素7min，流水冲洗去苏木素液，1%盐酸乙醇1s,流水冲洗，伊红染色20s,流水冲洗，75%乙醇1s,85%乙醇1s,95%乙醇1s,100%乙醇1s,二甲苯（II）1s,二甲苯（I）1s，晾干30min,中性树胶封片。实验结果见图1。如图1a所示，HE染色实验结果显示，对照组小鼠的肝小叶结构清晰完整，肝细胞呈多面体形，未产生胶原纤维堆积和炎症。四氯化碳模型组小鼠的肝小叶结构紊乱且不完整，肝索被大量沉积的胶原纤维分隔，并伴有炎症细胞浸润。抗菌肽YD给药组小鼠肝小叶分隔不明显但组织结构较完整，中央静脉周围可见部分肝索结构，胶原纤维沉积较少，纤维化程度减轻。4.肝功能检测在肝功能检查中，谷丙转氨酶（ALT）反映肝细胞受损的指标，谷草转氨酶（AST）是反映肝细胞坏死的标准。ALT和AST结合起来反映肝功能的状况。当器官发生纤维化时，血清中ALT和AST的含量会明显升高。本专利技术通过ALT和AST测试盒测定对照组、四氯化碳模型组和抗菌肽YD给药组小鼠血清中的ALT和AST含量，通过酶标仪测定血清中ALT和AST的含量。具体实验过程为：将给药实验结束后的小鼠用乙醚麻醉，从眼眶静脉丛取血，置于已灭菌的1.5mLEP管中，室温下自然凝固20-30min后，离心30min（5000r/min)，收集上清，使用测试盒测定ALT和AST含量。实验结果见图1，如图1b和1c所示，与对照组相比，四氯化碳模型组小鼠血清中ALT和AST含量明显升高，差异极显著（P<0.01）；与四氯化碳模型组相比，抗菌肽YD给药组小鼠血清中ALT和AST含量明显降低，差异极显著（P<0.01）。以上结果说明，经过抗菌肽YD的腹腔注射给药，与模型组相比，小鼠血清与肝脏组织中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用。2.如权利要求1所述的抗菌肽YD在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用，其特征是：以抗菌肽YD为活性成分，采用药剂学常规工...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢俊秋，王锐，闫志斌，王丹，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62