一种散射荧光双模态流式成像系统技术方案

本发明专利技术提供一种散射荧光双模态流式成像系统，包括具有激发光源和光束整形模块的多色正交照明单元，包括物镜、多光谱分像器和多个相机的多通道显微成像单元，以及与所述物镜共轴的进样管。所述激发光源能够发射两个或多个波长的激发光，经所述光束整形模块整形后，在与所述物镜焦面重合的位置处垂直照射所述进样管。所述物镜收集生物颗粒发出的散射光和荧光，所述多光谱分像器按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及一个或多个荧光通道投射至不同的相机进行成像。整套系统原理基于光片照明的侧向散射和荧光发射显微成像技术，能够取得更准确的浮游生物观测结果，并适应更广谱的水域浮游生物物种范围和非生命颗粒物的在线测量需求。

A Scattering Fluorescence Dual-mode Flow Imaging System

【技术实现步骤摘要】
一种散射荧光双模态流式成像系统
本专利技术属于生物及环境领域的光学仪器技术，具体涉及到一种新型的流式成像系统。
技术介绍
浮游生物是水域生态系统的基础组成部分，在整个食物链物质循环和能量流动中起到重要的作用。对浮游生物的生理、生态、多样性和过程了解是海洋资源、生物多样性、生态系统对气候变化响应等研究的基础需求。然而，尽管现有浮游生物观测技术和观测平台已有一定发展，但是识别与定量技术在检测的通量、特异性与准确性上仍然严重不足，是目前与未来相关科学研究和水环境监测需要面对的主要挑战之一。水域环境除了具有广阔性，还掺杂有大量与浮游生物尺度类似的非生命颗粒物。这与浮游生物的微小性、异质性构成天然矛盾，造成对浮游生物大时空尺度准确观测的巨大挑战。各种观测技术的最终目的是对海洋浮游生物的分布、丰度、种群结构、大小或生物量进行及时准确的测量或估计。然而现有技术均难以突破观测准确性和通量间的矛盾，亟需从检测方法原理上寻求突破，发展通量更高、检测更准、可在现场工作的分析技术和仪器。迄今为止，基于形态学的光学镜检仍然是最为广泛使用的浮游生物鉴定和分析经典方法。随着数字技术的进步，将高速数字成像与计算机人工智能结合，将有可能大幅提升镜检通量，获得更准确、更客观、更高效、更可重复的浮游生物观测结果。这一思想催生了成像流式细胞测量术(imagingflowcytometry)的诞生与发展。这一技术结合了光学显微镜与传统非成像流式细胞仪的原理与优势，可在细胞流动中高通量获取其二维图像。相比人工/自动镜检，它的进样和成像速度更快，检测通量大幅提升；相比非成像流式细胞仪，它获取的细胞形态细节信息更丰富，更接近广泛使用的经典形态学镜检。然而，现有成像流式细胞测量术在应用于天然水样中的浮游生物检测分析时，仍有很多缺陷和不足。例如，FlowCAM和ImagingFlowCytoBot(IFCB)是两种专用于浮游植物观测的成像流式细胞仪系统。两种仪器的显微摄影均基于明场成像原理，在拍摄高速流动细胞时，受到离焦模糊和拖尾模糊的困扰，难以同时对较大粒径范围内的细胞清晰成像。由于两种仪器难以应用高倍物镜，导致成像分辨率和灵敏度较差，检测2μm内的细胞困难。为了避免拖尾模糊，上述仪器均采用了闪光照明的方法提高快门速度“抓拍”细胞；但是曝光时间的大幅缩短导致图像信噪比恶化，降低测量精度。此外，上述仪器会在高流速时漏拍细胞，在低流速时出现同视野重复拍摄，造成严重的统计误差。Amnis系列成像流式细胞仪采用时间延时积分成像技术，可对细胞同时实现明场、暗场和荧光多光谱流式显微成像。相比于明场成像，可在细胞形态信息基础上额外获取更为丰富的生化信息用于比对分析。但是在时间延时积分成像中，细胞流动与相机的曝光读出需要通过复杂的测速反馈机制精确同步，否则仍会造成拖尾模糊；通过后期计算拓展有效景深的方法增加了仪器复杂度和成本，图像后处理操作也会占用大量处理时间，降低了流式成像测量的有效通量。目前该仪器的常规放大倍率为40倍，进样通道尺度仅为120μm，在实际使用中容易堵塞。由于该仪器的设计初衷是为实验室内生物医学细胞的检测，因此并不适用于对成分复杂的天然水样进行直接分析，更不可能用于水域现场环境。为了解决上述成像技术问题，并充分考虑和利用水体中浮游生物及非生命颗粒物的光学信息特点，一种新型的光片荧光流式成像技术应运而生。这一技术与其他成像流式细胞术的方法学根本不同在于：不再是成像光轴与细胞流动方向正交，而是共轴；激发光与成像光轴不再是共轴，而是垂直，且在空间中被束缚至仅对焦深以内目标激发照明。相比于前述仪器，这一技术在对例如自发荧光浮游植物的测量效果上具有成像质量高、测量灵敏度高、测量精度高、样品无损和测量通量高的明显优点，因此十分适合于浮游植物的现场在线观测。然而，光片荧光流式成像技术在对浮游生物观测问题的解决上仍然还有很多局限。首先，目前该技术只能依靠浮游生物体内的某些色素自发荧光作为成像对比度机制，因此难以对不能发射自发荧光的目标或其部分实现准确成像测量，这局限了其对大多数浮游动物和浮游细菌的应用前景。其次，很多浮游植物特别是20μm以上的微型和小型真核细胞，其细胞壁、鞭毛等透明结构通常不含荧光色素，这些形态学结构往往是特定浮游植物种类的独有特征；无法对这些特征观测不仅对造成后续识别困难，还会造成细胞大小和/或计数测量的错误。最后，各种分子技术的发展不仅可为不含自发荧光色素的浮游生物进行荧光标记，还可以大大增加其检测特异性；然而现有光片荧光成像流式细胞术的激发波长单一，光谱成像通道不足，无法满足对更多不同荧光标记更广光谱范围内的多光谱成像检测需求。
技术实现思路
为解决现有光片荧光流式成像细胞测量技术的上述局限以及其它成像流式细胞测量术的缺点，本专利技术提供一种散射荧光双模态流式成像系统，其原理基于光片照明的侧向散射和荧光发射显微成像技术，能够取得更准确的浮游生物观测结果，并适应更广谱的水域浮游生物物种范围和非生命颗粒物的在线测量需求。具体地，本专利技术的一种散射荧光双模态流式成像系统，包括：多色正交照明单元，其包括相互配合的激发光源和光束整形模块；所述激发光源能够发射两个或多个波长的激发光。多通道显微成像单元，其包括物镜、多光谱分像器和多个相机；所述物镜收集生物颗粒发出的散射光和荧光；所述多光谱分像器按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及荧光通道投射至不同的相机进行成像；其中，所述散射通道可以为一个，也可以为一个以上，荧光通道的数量例如为两个，或者其它所需的个数。进样管与所述物镜共轴，所述激发光源发出的光束，经所述光束整形模块整形后，在与所述物镜焦面重合的位置处，垂直照射所述进样管。本专利技术的系统中，所述激发光源可以有多种设计，包括：1、所述两个或多个波长的激发光分别由不同的单波长激光器发出；2、所述两个或多个波长的激发光由多波长合束激光器发出；3、所述两个或多个波长的激发光由超连续激光器配合窄带可调谐滤光器发出。进一步，所述两个或多个波长的激发光由激光器在自由空间输出。为了进一步使得系统紧凑以方便现场使用，所述两个或多个波长的激发光也可以由激光器通过光纤输出。为了保证照明光场的均匀，照明光通常要垂直入射到进样管中，因而进样管的截面设计为多边形，而不是圆弧形，从而避免圆弧形对光束折射等所带来的影响。所述多边形具有2n条边，其中n为大于等于2的自然数。对于截面为不同边数的多边形，其实也优选适用于不同个数的激发波长，具体优选地：当所述激发光源能够发射两个波长的激发光时，所述进样管的截面为四边形；当所述激发光源能够发射三个波长的激发光时，所述进样管的截面为六边形；当所述激发光源能够发射四个波长的激发光时，所述进样管的截面为四边形。对于光片照明光场的实现，本专利技术优选在所述光束整形模块中使用一维90°抛物面镜来形成光片照明光场，如此能够省去柱透镜甚至显微物镜等光学器件，在照明光场仍能保持一定适应性的基础上进一步使得系统更加紧凑。由于散射光强通常大于荧光光强，因而需要平衡各个通道的光信号以使得融合图像更加准确。优选以下三种方案：在所述散射通道中设置有中密度滤光片以对散射光信号进行衰减；或者，采用使得所述散射通道对应相机的增益低于所述荧光通道对应相机的增益的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种散射荧光双模态流式成像系统，包括，多色正交照明单元(A)，其包括相互配合的激发光源(1)和光束整形模块(2)；所述激发光源(1)能够发射两个或多个波长的激发光；多通道显微成像单元(B)，其包括物镜(4)、多光谱分像器(5)和多个相机；所述物镜(4)收集生物颗粒发出的散射光和荧光；所述多光谱分像器(5)按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及荧光通道投射至不同的相机进行成像；进样管(3)与所述物镜(4)共轴，所述激发光源(1)发出的光束，经所述光束整形模块(2)整形后，在与所述物镜(4)焦面重合的位置处，垂直照射所述进样管(3)。

【技术特征摘要】
1.一种散射荧光双模态流式成像系统，包括，多色正交照明单元(A)，其包括相互配合的激发光源(1)和光束整形模块(2)；所述激发光源(1)能够发射两个或多个波长的激发光；多通道显微成像单元(B)，其包括物镜(4)、多光谱分像器(5)和多个相机；所述物镜(4)收集生物颗粒发出的散射光和荧光；所述多光谱分像器(5)按照特定的光谱通带将所述散射光和荧光分由散射通道以及荧光通道投射至不同的相机进行成像；进样管(3)与所述物镜(4)共轴，所述激发光源(1)发出的光束，经所述光束整形模块(2)整形后，在与所述物镜(4)焦面重合的位置处，垂直照射所述进样管(3)。2.根据权利要求1所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，所述两个或多个波长的激发光分别由不同的单波长激光器发出；或者，所述两个或多个波长的激发光由多波长合束激光器发出；或者，所述两个或多个波长的激发光由超连续激光器配合窄带可调谐滤光器发出。3.根据权利要求2所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，所述两个或多个波长的激发光由激光器在自由空间输出，或者由激光器通过光纤输出。4.根据权利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，所述进样管(3)的截面为多边形，所述多边形具有2n条边，其中n为大于等于2的自然数。5.根据权利要求4所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，当所述激发光源(1)能够发射两个波长的激发光时，所述进样管(3)的截面为四边形；当所述激发光源(1)能够发射三个波长的激发光时，所述进样管(3)的截面为六边形；当所述激发光源(1)能够发射四个波长的激发光时，所述进样管(3)的截面为四边形。6.根据利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，所述光束整形模块(2)包括一维90°抛物面镜，使用所述一维90°抛物面镜形成光片照明光场。7.根据权利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，在所述散射通道中设置有中密度滤光片；或者，在所述散射通道中设置有中密度滤光片和偏振片。8.根据权利要求1-3任一项所述的散射荧光双模态流式成像系统，其特征在于，进一步包括反馈单元，所述反馈单元能够根据所述散射通道和所述荧光通道的图像光强信息反馈调节所述激发光源(1)的信号。9.根据权利要求1-3任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李军，陆昱，
申请(专利权)人：深圳市趣方科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44