异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法及其引物和探针技术

本发明专利技术公开了一种异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法及其引物和探针，该方法设计异鳞蛇鲭的引物和探针，并提取异鳞蛇鲭样品中的DNA；根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。本发明专利技术可有效地以实时荧光PCR方法对异鳞蛇鲭进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。

Detection of mackerel by fluorescent PCR and its primers and probes

【技术实现步骤摘要】
异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法及其引物和探针
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法及其引物和探针。
技术介绍
鳕鱼被称为“餐桌上的营养师”，可见它的营养价值之高。但市面上鳕鱼的名目繁多，真鳕、银鳕、黑鳕、狭鳕、青鳕、水鳕，龙鳕、圆鳕、扁鳕等等，这些鳕鱼名只能算是一种商品名，生物学分类中只有鳕形目，鳕科，鳕属的鱼类才是真正的鳕鱼，而鳕属只包括大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)，格陵兰鳕鱼(Gadusogac)和太平洋鳕鱼(Gadusmacrocephalus)这3种，但格陵兰鳕鱼产量较低市场上少见。异鳞蛇鲭，俗称“油鱼”或“龙鳕鱼”或“水鳕鱼”，属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii)鲈形目(Perciformes)异鳞蛇鲭属(Lepidocybium)，由于价格低廉且一旦去头、去脏、去骨、去皮切块或切片之后其肉质外观酷似鳕鱼而常被假冒成鳕鱼进行销售。但异鳞蛇鲭由于鱼体内含有一种名叫蛇鲭毒素的天然蜡酯，蜡酯在人体内难以消化，食用后容易导致胃痉挛，油脂囤积在直肠，导致排油性腹泻，严重时导致死亡。动物物种成分检测是打击异鳞蛇鲭假冒鳕鱼的有效手段，但目前并没有一种针对异鳞蛇鲭成分的高效准确的检测方法。形态学方法是传统的动物物种种属鉴定方法，但市售的鳕鱼往往都以肉段肉块的形式出现，因此往往不能满足对鱼肉制品售假现象的监管与控制的需求。种属鉴定的免疫学方法大都直接鉴定样本中的蛋白成分，其基本原理是抗体抗原反应，但免疫学方法存在对样本材料要求高，检测准确率低等缺陷，如动物食品若经过加热、腌制等处理，其蛋白结构一旦遭到破坏，免疫学方法便不再适用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法及其引物和探针，可有效地以实时PCR方法对异鳞蛇鲭进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：提供一种异鳞蛇鲭的引物和探针，其中，所述引物和探针由下表中的序列组成：其中，LF-F表示上游引物；LF-R表示下游引物；LF-P表示探针。为解决上述问题，本专利技术还提供一种异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法，其中，至少包括如下步骤：S1：设计异鳞蛇鲭的引物和探针，所述引物和探针由下表中的序列组成：其中，LF-F表示上游引物；LF-R表示下游引物；LF-P表示探针；S2：提取异鳞蛇鲭样品中的DNA；S3：根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；S4：将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。其中，所述上游引物的浓度为10pmol/μL，下游引物的浓度为10pmol/μL，探针的浓度为10pmol/μL。其中，步骤S2具体为：S21：获取0.2g异鳞蛇鲭样品，并在液氮中研磨；S22：使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；S23：将抽提后的DNA溶解在100μL水中，获得DNA液。其中，步骤S3具体为：S31：获取10μL的PremixExTaq，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.4μL的探针以及1μL的DNA液，并加水补足至20μL；S32：使用实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR扩增反应，其中实时荧光PCR扩增反应的程序如下：95℃预变性10sec；95℃变性5sec；60℃退火并延伸23sec，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。其中，在步骤S3后，还包括步骤S30：设置阳性对照、阴性对照及提取空白对照。其中，在步骤S4之前，还包括步骤S40：获取真核生物的引物和探针，并作为内参照引物和探针；其中真核生物的引物和探针见下表：*引用自GB/T25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提DNA的质量；其中18SrRNA-F表示上游引物，18SrRNA-R表示下游引物，18SrRNA-P表示探针。其中，步骤S4具体为：S41：若检测结果显示空白对照、阴性对照无FAM荧光信号，阳性对照Ct值小于等于30，则判定实时荧光PCR扩增反应有效，否则反应无效；S42：在实时荧光PCR扩增反应有效的前提下，用内参照引物探针筛选出Ct值≤30的样品；S43：在Ct值≤30的样品中的特异性曲线出现扩增曲线时，则表示DNA抽提有效，否则应重新提取DNA，直至Ct值≤30；S44：在实时荧光PCR扩增反应有效，且抽提的DNA有效的情况下，异鳞蛇鲭的特异性引物探针检测得到的Ct值≤35时，则判断样品为阳性，若Ct值＞35，则判断样品为阴性。区别于现有技术，本专利技术通过设计适用于异鳞蛇鲭的引物和探针，并用于实时PCR检测，可有效地以实时PCR方法对异鳞蛇鲭进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。首先应当说明的是，本专利技术涉及异鳞蛇鲭(Lepidocybiumflavobrunneum)的实时荧光PCR(Real-TimePCR)检测方法。基于具有高度物种特异性的异鳞蛇鲭线粒体12S核糖体RNA(12SribosomalRNA)序列(GenBank:AP012519.1)设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以Real-TimePCR的方法对异鳞蛇鲭进行物种成分检测。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，可协助有关部门有效打击鱼类，特别是鳕鱼及其制品贩假的恶劣行径。本专利技术属于分子生物学方法，基于核酸等遗传物质的高稳定性和多样性等特点，可广泛应用于物种种属鉴定，特别是以PCR技术为基础的核酸检测方法被应用到物种鉴别已有20年的历史。实时荧光PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。利用实时荧光PCR技术本专利技术中的引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，可有效的用于鱼肉的真伪鉴别。具体对：为了实现上述目的，本专利技术提供一种异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法，其中，至少包括如下步骤：S1：设计异鳞蛇鲭的引物和探针，所述引物和探针由表1中的序列组成：表1其中，LF-F表示上游引物；LF-R表示下游引物；LF-P表示探针；S2：提取异鳞蛇鲭样品中的DNA；S3：根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；S4：将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。具体地，步骤S2中样本DNA提取。取0.2g异鳞蛇鲭肌肉组织，在液氮中充分研磨后，使用DNA抽提试剂盒(PromegaFF3750)进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在100μL水中；步骤S3中实时荧光PCR扩增检测。引物探针序列如表1所示。实时荧光PCR反应体系如下：10μL的PremixExTaq(Takara)，上游引物(10pmol/μL浓度)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，取上述提取的DNA液1μL，用水补足体积至20μL。应用荧光定量PCR仪lightcycle480(Roche)进行反应，反应程序为：95℃预变性10sec；95℃变性5sec；60℃退火并延伸23sec，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。步骤S4中结果判定。Ct(Cyc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异鳞蛇鲭的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针由下表中的序列组成：

【技术特征摘要】
1.一种异鳞蛇鲭的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针由下表中的序列组成：其中，LF-F表示上游引物；LF-R表示下游引物；LF-P表示探针。2.一种异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法，其特征在于，至少包括如下步骤：S1：设计异鳞蛇鲭的引物和探针，所述引物和探针由下表中的序列组成：其中，LF-F表示上游引物；LF-R表示下游引物；LF-P表示探针；S2：提取异鳞蛇鲭样品中的DNA；S3：根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；S4：将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。3.根据权利要求2所述异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述上游引物的浓度为10pmol/μL，下游引物的浓度为10pmol/μL，探针的浓度为10pmol/μL。4.根据权利要求3所述异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S2具体为：S21：获取0.2g异鳞蛇鲭样品，并在液氮中研磨；S22：使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；S23：将抽提后的DNA溶解在100μL水中，获得DNA液。5.根据权利要求4所述异鳞蛇鲭的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S3具体为：S31：获取10μL的PremixExTaq，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.4μL的探针以及1μL的DNA液，并加水补足至20μL；S32：使用实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR扩增反应，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴姗，虞惠贞，董强，
申请(专利权)人：福建译宁科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35