一种牦牛肉鉴定试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及分子检测领域，尤其涉及一种牦牛及杂交后代犏牛肉的鉴定试剂盒。本发明专利技术提供了一种牦牛肉鉴定试剂盒，其特征在于：它包括PCR试剂和膜芯片；所述PCR试剂包括：a)扩增牦牛12S rRNA基因的引物，如SEQ ID NO.13～14所示；b)扩增黄牛12S rRNA基因的引物，如SEQ ID NO.7～8所示；c)扩增牦牛或黄牛ZNF280B基因的引物，如SEQ ID NO.31～32所示；每个引物对中的1个引物的5’端带有生物素标记；所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的核酸探针组成；所述核酸探针的序列如SEQ ID NO.9、15、33和34所示。本发明专利技术能快速有效地鉴别牦牛肉真伪，并能鉴别真犏牛和假犏牛，具有良好的应用价值。

A Kit for Identification of Yak Beef

【技术实现步骤摘要】
一种牦牛肉鉴定试剂盒
本专利技术涉及分子检测领域，尤其涉及一种牦牛肉的鉴定试剂盒。
技术介绍
牦牛肉干市场受到假货的极大冲击，不法分子利用水牛、黄牛及猪肉等低价值肉类制造手撕牦牛肉、风干牦牛肉等肉制品进行销售，极大的扰乱了市场。一方面损害了消费者权益，降低人民对食品安全的信任度，造成不良社会影响；据统计，国内市场假牦牛肉干的比例高达80％，国际市场上也发现了15-39％的假牦牛肉，形成更恶劣的影响。更为严重的是假冒牦牛肉制品以其“低廉”的价格“抢占市场”，严重扰乱牦牛肉干市场，拉低了牦牛肉的市场价格。使一种珍稀、高端、生态、绿色肉类食品以很低的价格进行市场销售，从而降低了藏区人民的经济收入，也使国家在西藏畜牧业经济方面的大量投入付之东流。为更好保证食品安全良性发展和我国藏区畜牧业安全生产，亟待开发一种快速准确技术和商业化试剂盒来进行真假牦牛及其杂交后代-犏牛肉的快速鉴别技术。经过调查，青藏高原及周边地区主要用于牦牛及犏牛肉干造假的动物种类有水牛、黄牛、猪、山羊、鸡、兔、鸭、狗等8种动物。另外，在青藏高原牧区有利用牦牛和黄牛杂交后代--犏牛进行生产的现象。其中以黄牛为父本，牦牛为母本杂交的后代称之为真犏牛；以牦牛为父本，黄牛为母本杂交的后代称之为假犏牛。犏牛产肉乳性能均高于牦牛，是青藏高原畜牧业产业的重要组成部分。在高原地区也利用犏牛肉进行肉干生产，所以也有对犏牛肉干进行鉴定的需求。目前已有使用可视化芯片检测肉类动物来源的方法，主要依赖于设计特异性引物、探针检测肉类线粒体基因。但未见能区分牦牛、真犏牛和假犏牛的相关芯片。设计相关芯片的主要难点在于：真犏牛与牦牛具有相同的线粒体基因组，只能靠检测核基因来实现真犏牛(体内有黄牛的核基因)与牦牛的鉴别；然而牦牛和黄牛的核基因序列差别很小，即便侥幸找到一段有差别的序列，其对应的差别也很小(比如1～2个碱基不同)，目前的可视化芯片还不具备区分这类差别的能力。
技术实现思路
专利技术人发现黄牛和牦牛的ZNF280B基因的某一段序列区别较大，可以用于特异性引物和探针的设计。基于此，本专利技术提供了一种牦牛及其杂交后代-犏牛肉的鉴定试剂盒和鉴定方法。本专利技术的技术方案如下：一种牦牛肉鉴定试剂盒，它包括PCR试剂和膜芯片；所述PCR试剂包括：a)扩增牦牛12SrRNA基因的引物，序列如SEQIDNO.13～14所示；b)扩增黄牛12SrRNA基因的引物，序列如SEQIDNO.7～8所示；c)扩增牦牛或黄牛ZNF280B基因的引物，序列如SEQIDNO.31～32所示；每个引物对中的1个引物的5’端带有标记物；所述标记物用于直接或间接产生检测信号；直接产生检测信号的如荧光标记物；间接产生检测信号的如抗原标记物(生物素、地高辛等)，可被带相应抗体的信号分子(比如带链霉亲和素的碱性磷酸酶)识别，通过(加入反应底物等手段)激发信号分子发生反应，产生检测信号；所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的核酸探针组成；所述核酸探针的序列如SEQIDNO.9、15、33和34所示。如前述的试剂盒，它还包括质控核酸；所述质控核酸分为2部分：(1)阳性探针与阴性探针，固定于支持膜表面；(2)阳性寡核苷酸单链DNA，它可与阳性探针杂交，但不能与阴性探针杂交。如前述的试剂盒，其特征在于：所述阳性探针的序列如SEQIDNO.35所示；和/或，所述阳性核苷酸单链DNA的序列如SEQIDNO.37所示；和/或，所述阴性探针的序列如SEQIDNO.36所示。如前述的试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂还包括扩增猪COX基因，以及鸭、狗、兔、鸡、羊的12SrRNA基因的引物；优选地，序列依次如SEQIDNO.4～5、16～17、19～20、22～23、25～26、28～29所示。所述核酸探针序列还包括检测猪COX基因，以及鸭、狗、兔、鸡、羊的12SrRNA基因的探针；优选地，序列依次如SEQIDNO.6、18、21、24、27、30所示。如前述的试剂盒，所述每个引物对中的1个引物的5’端所带的标记物是生物素。如前述的试剂盒，它还包括去活化液、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和显色液；所述去活化液为80～120mmol/L的NaOH溶液；优选为100mmol/L的NaOH溶液；所述碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，为碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的粉末、母液或工作液；所述工作液使用含0.5％(w/v)SDS的2×SSPE缓冲液配制；所述显色液为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰的混合溶液。如前述的试剂盒，所述碱性磷酸酶标记的链霉亲和素的工作浓度为0.5mg/L；和/或，所述5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的工作浓度为0.15mg/mL；和/或，所述氯化硝基四氮唑兰的工作浓度为0.3mg/mL。如前述的试剂盒，它还包括去活化清洗液、杂交清洗液、孵育清洗液1、孵育清洗液2；所述去活化清洗液为含0.1％(w/v)SDS的2×SSPE缓冲液；所述杂交清洗液为含0.5％(w/v)SDS的2×SSPE缓冲液；所述孵育清洗液1为含0.5％(w/v)SDS的2×SSPE缓冲液；所述孵育清洗液2含有0.3mol/LNaCl，20mmol/LNaH2PO4，20mmol/LEDTA·Na2，其pH为7.4。一种采用前述试剂盒鉴定牦牛肉真伪的方法，包括如下步骤：1)提取样品DNA；2)以步骤1)中的DNA为模板、借助试剂盒中的PCR试剂进行多重PCR；修饰引物与非修饰引物用量的摩尔比是3∶2；所述修饰指生物素标记；3)使用NaOH溶液对芯片进行去活化；4)芯片与PCR产物杂交；5)用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素溶液孵育芯片；6)使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰与结合在芯片上的碱性磷酸酶反应显色；上述步骤3)～步骤6)均包括洗涤芯片的操作。如前述的方法，其特征在于，步骤4)中的杂交还包括权利要求2所述阳性寡核苷酸单链DNA与阳性探针杂交。本专利技术具有如下有益效果：1)特异性强。可特异性地鉴别包括猪、黄牛、山羊、鸡、兔、鸭、水牛、牦牛、狗、真犏牛、假犏牛等11种动物来源样本。2)灵敏度高。检测灵敏度高达0.1ng，对羊的DNA的检测灵敏度可达到0.01ng3)由于本专利技术找到了关键的ZNF280B基因的特异性基因片段，可以鉴别牦牛肉产品的真假，还能有效区分牦牛、真犏牛和假犏牛肉产品。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：芯片上探针的布局图。图2：特异性检测图。图3：灵敏度检测图。图4：市场食品样本检测图。具体实施方式实施例1芯片制备将尼龙膜裁成1.2cm×1.8cm的膜条，作为支持膜，裁好的膜条于双蒸水中浸泡15min，再用15×SSC缓冲液浸泡15min，取出，置于滤纸上，60℃烘1.5小时，待膜条降温到室温后，将内参探针(5μM)、11种检测探针(5μM)、阳性探针PC(5μM)以及阴性探针NC(5μM)，按图1所示顺序依次点制于膜条上，每个探针0.1-0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牦牛肉鉴定试剂盒，其特征在于：它包括PCR试剂和膜芯片；所述PCR试剂包括：a)扩增牦牛12S rRNA基因的引物，如SEQ ID NO.13～14所示；b)扩增黄牛12S rRNA基因的引物，如SEQ ID NO.7～8所示；c)扩增牦牛或黄牛ZNF280B基因的引物，如SEQ ID NO.31～32所示；每个引物对中的1个引物的5’端带有标记物；所述标记物用于直接或间接产生检测信号；所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的核酸探针组成；所述核酸探针的序列如SEQ ID NO.9、15、33和34所示。

【技术特征摘要】
1.一种牦牛肉鉴定试剂盒，其特征在于：它包括PCR试剂和膜芯片；所述PCR试剂包括：a)扩增牦牛12SrRNA基因的引物，如SEQIDNO.13～14所示；b)扩增黄牛12SrRNA基因的引物，如SEQIDNO.7～8所示；c)扩增牦牛或黄牛ZNF280B基因的引物，如SEQIDNO.31～32所示；每个引物对中的1个引物的5’端带有标记物；所述标记物用于直接或间接产生检测信号；所述膜芯片由支持膜和固定于支持膜上的核酸探针组成；所述核酸探针的序列如SEQIDNO.9、15、33和34所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它还包括质控核酸；所述质控核酸分为2部分：(1)阳性探针与阴性探针，固定于支持膜表面；(2)阳性寡核苷酸单链DNA，它可与阳性探针杂交，但不能与阴性探针杂交。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性探针的序列如SEQIDNO.35所示；和/或，所述阳性核苷酸单链DNA的序列如SEQIDNO.37所示；和/或，所述阴性探针的序列如SEQIDNO.36所示。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR试剂还包括扩增猪COX基因，以及鸭、狗、兔、鸡、羊的12SrRNA基因的引物；优选地，序列依次如SEQIDNO.4～5、16～17、19～20、22～23、25～26、28～29所示。所述核酸探针序列还包括检测猪COX基因，以及鸭、狗、兔、鸡、羊的12SrRNA基因的探针；优选地，序列依次如SEQIDNO.6、18、21、24、27、30所示。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：每个引物对中的1个引物的5’端所带的标记物是生物素。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：它还包括去活化液、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和显色液；所述去活化液为80～120mmol/L的...

【专利技术属性】
技术研发人员：江明锋，文勇立，王誉，曾莲，韩嘉钰，黄盈，周航，
申请(专利权)人：西南民族大学，四川华汉三创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51