一种紫貂裘皮制品真伪鉴别的MGB探针检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于MGB探针的实时荧光定量PCR法鉴定紫貂裘皮制品真伪的检测方法，包括紫貂上游引物：MzF；紫貂下游引物：MzR；紫貂MGB探针：MzP；检测方法：提取样品毛的DNA；对样品DNA进行qPCR扩增；对扩增曲线分析后判定结果。通过特异性、灵敏度、重复性和盲测实验，结果表明，本发明专利技术特异性好、灵敏度高、效率高，可以快速、准确地检测紫貂裘皮制品的真伪，具有良好的市场应用前景。

A Method for Detecting the Authenticity of Mink Fur Products by MGB Probe

【技术实现步骤摘要】
一种紫貂裘皮制品真伪鉴别的MGB探针检测方法
本专利技术属于分子物种鉴定
，具体涉及一种基于MGB探针的实时荧光定量PCR法对紫貂裘皮制品的真伪进行鉴定的方法。本专利技术检测方法快速、准确。
技术介绍
紫貂(Marteszibellina)，属食肉目、鼬科、貂属。主要分布于北亚大陆及临近岛屿，俄罗斯、中国、蒙古及朝鲜等国。在中国，主要分布在东北地区和新疆地区，北纬41°以北的针叶林以及温带针阔混交林。紫貂是珍贵毛皮兽类，是“东北三宝”之一，素有“裘中之王”之称，具有“见风愈暖、落雪则融、遇水不濡”的美誉。在皮毛市场巨大的经济利益驱动下，许多不法分子大肆偷猎紫貂，导致紫貂野生种群数量不断减少，目前中国已将其列为国家一级重点保护动物。同时，裘皮市场上，以其他毛皮冒充紫貂皮的情况屡禁不止。深加工过的裘皮制品在形态特征和理化特性等方面都发生很大改变，因此原有的直观观察法、扫描电镜法、DNA测序法等已经不能满足毛皮的精准鉴定。实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。相比于常规TaqMan探针法，MGB探针法的优势有两点：一是探针3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，取代常规可发光的TAMRA分子，使荧光本底降低，荧光光谱分辨率提高；二是探针3’端另结合了MGB——DNA小沟结合物，使得较短的探针可以获得较高Tm值，增加了探针的杂交稳定性，结果更精确，分辨率更高。本专利技术建立了一种用于紫貂裘皮制品真伪识别的MGB探针的实时荧光定量PCR检测方法，利用MGB探针，能够高效、准确的检测毛皮制品是否为紫貂，避免其他毛皮假冒紫貂毛皮制品的现象，同时能为偷盗偷猎紫貂的案件提供关键证据。线粒体的COI基因是目前国内外公认的DNA条码，本专利技术针对COI基因设计引物和MGB探针。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是设计针对紫貂的物种特异性引物和探针。本专利技术的第二个目的是建立快速、准确区分紫貂裘皮制品真伪的分子检测方法。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：1、DNA的提取体系取紫貂针毛至少10根(平均3～4cm)或绒毛5mg放置于2ml离心管中，剪碎，加入280μlTNE、30μlSDS、20μlDTT、20μl蛋白酶K，加入150μlBufferC-L(AXYGEN动物基因组提取试剂盒)，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。离心步骤参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液，离心1min。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液80μl洗脱DNA，-20℃冷冻备用。2、引物和探针的设计选取Genbank上已发表的紫貂的线粒体COI序列(KJ202644、KJ202643、KJ202642和FJ429093)，以及相关物种的同源序列，利用MegAlign进行比对后，选择紫貂物种特异的碱基序列，利用ABIprimerexpress3.0设计引物与MGB探针，Primer6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用Blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。引物和探针设计结果：3、本专利技术中qPCR检测方法的建立在FastStartUniversaProbeMaster(Rox)的基础上，建立20μl反应体系，其中上、下游引物和MGB探针的量从0.3μl到1.5μl，以0.1μl为梯度递加。反应体系中加入模板7μl。根据荧光定量PCR的结果，选择最大的荧光增量和最好的曲线走势作为判定标准，选择引物和探针的最适量。最优反应体系为：FastStartUniversaProbeMaster(Rox)10μl，上游引物MzF0.5μl，下游引物MzR0.5μl，MGB探针0.5μl，DNA模板7μl，ddH2O1.5μl。PCR反应程序如下：95℃10min；95℃10s，60℃30s，50个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。PCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃30s40个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。判图原则：Ct值小于等于35并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于40判为阴性；Ct值介于35～40之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值比原来减小并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。4、本专利技术中qPCR特异性实验利用紫貂引物和探针，分别加入紫貂皮、鞣质紫貂针毛、水貂、石貂、松貂、黄喉貂、白鼬、麝鼠、貉、浣熊、北极狐、赤狐、藏狐、沙狐、狼、狗、家猫、豹、雪豹、东北虎、孟加拉虎、豹猫、漠猫、猞猁、双峰驼、羊、水牛、羊驼、黑熊、棕熊、马来熊、小灵猫的DNA模板进行荧光特异性的实验，反应体系按照qPCR检测方法所确定的最佳反应体系建立。5、本专利技术中qPCR的灵敏度实验将紫貂皮的DNA提取液原液按照10倍的梯度倍比稀释，得到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的DNA溶液。依次用紫貂引物和探针进行检测。6、重复性实验取紫貂皮、紫貂鞣质针毛样品各10份，分别用紫貂的引物和探针进行检测，检测结果进行回判率分析。7、盲测实验随机准备10份样品，其中1份为紫貂样品，另外9份为其他物种样品。对此10份样品进行盲测实验，通过该盲测实验对本方法的有效性进行检验。附图说明图1紫貂引物探针特异性实验结果图2紫貂梯度灵敏度实验图3重复性实验结果图4盲测实验结果具体实施方式实施例1疑似紫貂裘皮制品的检测1、DNA的提取体系取紫貂针毛10根(平均3～4cm)放置于2ml离心管中，剪碎，加入280μlTNE、30μlSDS、20μlDTT、20μl蛋白酶K，加入150μlBufferC-L(AXYGEN动物基因组提取试剂盒)，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管置于56℃水浴中过夜消化处理。离心步骤参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液，离心1min。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液80μl洗脱DNA，-20℃冷冻备用。2、体系和程序对于待测样品，用20μl含有紫貂探针引物的反应体系进行检测分析。20μl反应体系包括：FastStartUniversaProbeMaster(Rox)10μl，上游引物Mz本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于MGB探针的实时荧光定量PCR法鉴定紫貂裘皮制品真伪的方法，其特征在于包括物种特异性引物和探针的序列如下：紫貂上游引物MzF：5’—CGCCCATGCATTTGTAATGA—3’紫貂下游引物MzR：5’—GTTTCCGAAGCCCCCAAT—3’紫貂探针MzP：5’—(NED)CTTCATAGTGATGCCAATTA(MGB)—3’。

【技术特征摘要】
1.一种基于MGB探针的实时荧光定量PCR法鉴定紫貂裘皮制品真伪的方法，其特征在于包括物种特异性引物和探针的序列如下：紫貂上游引物MzF：5’—CGCCCATGCATTTGTAATGA—3’紫貂下游引物MzR：5’—GTTTCCGAAGCCCCCAAT—3’紫貂探针MzP：5’—(NED)CTTCATAGTGATGCCAATTA(MGB)—3’。2.根据权利1所述的基于MGB探针的实时荧光定量PCR法鉴定紫貂裘皮制品真伪的方法，其特征在于构建20μl荧光反应体系，由以下组分组成：FastStartUniversaProbeMaster(Rox)10μl，上游引物MzF0.5μl，下游引物MzR0.5μl，MGB探针0.5μl，DNA模板7μl，ddH2O1.5μl。PCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃30s，50个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。3.一种采用如权利1、权利2所述的基于MGB探针的实时荧光定量PCR法鉴定紫貂裘皮制品真伪的方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品DNA。B、对步骤A中的样品DNA进行qPCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：FastStartUniversaProbeMaster(Rox)10μl，上游引物MzF0.5μl，下游引物MzR0.5μl，MGB探针0.5μl，DNA模板7μl，去离子水1.5μl。qPCR反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃30s，50个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。所述的引物和探针：紫貂上游引物MzF：5’—CGCCCATGCATTTGTAATGA—3’紫貂下游引物MzR：5’—GTTTCCGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：白素英，徐琳雅，张伟，张宇，刘微，李波，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23