乌鸫系统发育树的构建方法技术方案

本发明专利技术公开了一种乌鸫系统发育树的构建方法，属于分子生物学技术领域，包括以下步骤：(1)采集乌鸫标本；(2)乌鸫mtDNA基因组的提取；(3)引物设计和PCR基因扩增；(4)测序、拼接及序列分析；(5)构建系统发育树，确定乌鸫及近缘物种系统分类地位；本发明专利技术分析乌鸫线粒体基因组序列特征以及重建了乌鸫与近缘物种系统发育树，一方面可以让乌鸫的分子信息库更加完整，有利于对该属物种以及近缘物种的进一步保护和利用，而且本发明专利技术也为其它鸟类的研究提供了研究基础和分子数据。

Construction Method of Phylogenetic Tree of Black Thrush

【技术实现步骤摘要】
乌鸫系统发育树的构建方法
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种乌鸫系统发育树的构建方法。
技术介绍
乌鸫(学名：Turdusmerula)，属于鸟纲(Aves)、雀形目(Passeriformes)、鸫科(Turdidae)、鸫属(Turdus)，其分布广泛，种群数量较多，在欧亚大陆、北非、印度次大陆、印度支那、斯里兰卡、马尔代夫，及中国的西南地区等地均为常见，分布高可至海拔4000m以上的山区。乌鸫是雌鸟孵卵，具有补卵行为和坐巢行为，为农林益鸟，某些地方利用乌鸫取食蝗虫、草地螟、地老虎等害虫的特点来达到生物防治害虫的目的。这种生物防治手段不仅有效控制了虫害，而且与公共植保、绿色植保、低碳植保方针相一致；所以，各种、亚种乌鸫的保护和利用越来越重要。但是，目前对于乌鸫的生物学信息和所处的系统进化地位了解很少，限制了对于各种、亚种乌鸫的进一步保护和利用。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于提供乌鸫系统发育树的构建方法，以解决上述问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种乌鸫系统发育树的构建方法，包括以下步骤：(1)采集乌鸫标本；(2)乌鸫总基因组的提取从步骤(1)采集的乌鸫标本中提取乌鸫总DNA；(3)引物设计和PCR基因扩增设计可覆盖乌鸫mtDNA全序列的引物，然后采用所述引物对步骤(2)所得的总DNA，进行PCR扩增，扩增所得目的片段之间的重叠为100-200bp，得到基因样本；(4)测序、拼接及分析将步骤(3)所得的基因样本进行测序，然后利用测得的数据分析其线粒体全基因组的成分、基因的排列顺序和碱基组成特征；再进行序列拼接，得到乌鸫线粒体基因组全序列，如SEQIDNO:1所示；根据拼接得到的基因组全序列确定乌鸫的13个蛋白质编码基因；预测各tRNA的二级结构，并根据预测结果绘制；最后对线粒体全基因组、13个蛋白质编码基因、22个tRNA、2个rRNA和D-loop进行特征分析；(5)构建系统发育树根据已知的鸟类的13个蛋白质编码基因，用白颊噪鹛和火尾希鹛13个蛋白质编码基因作为外群，去终止密码子后拼接，构建得到系统发育树。作为优选的技术方案：步骤(2)中，提取方法为SDS-酚-氯仿-异戊醇抽提法。作为优选的技术方案：步骤(3)中，设计引物的方法为：根据NCBI上现已提交的6个乌鸫近缘物种的mtDNA全基因组序列，使用Primer5.0设计。作为优选的技术方案：步骤(3)中，设计的引物对为12对，其具有如T1-T12所示的序列。作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述序列拼接的方法为DNABaserAssembler和人工排查。作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述确定乌鸫的13个蛋白质编码基因的方法为：利用BLAST进行同源性搜索，通过对比NCBI上前人所提交的鸫属其它鸟类的线粒体全基因组。作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述特征分析包括碱基组成成分、A+T含量、A/T和G/C偏斜以及13PCGs的密码子使用频率。作为优选的技术方案：步骤(5)中，构建系统发育树的方法为MEGA7.0的最大似然法和邻接法。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术构建的乌鸫系统发育树，一方面可以让乌鸫的信息库更加完整，利于对于各种、亚种乌鸫的进一步保护和利用，而且本专利技术也为其它鸟类的研究提供了研究基础。附图说明图1为乌鸫线粒体全基因组电泳结果图；图2为乌鸫线粒体基因组PCR电泳结果图；图3为乌鸫线粒体基因组组织结构图；图4为乌鸫线粒体基因组22个tRNA二级结构图；图5乌鸫线粒体基因D-loop结构图；图6为鸫科、椋鸟科、鹟科、山雀科基于13个蛋白质编码基因的ML树图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术作进一步说明。实施例：一种乌鸫系统发育树的构建方法，包括以下步骤：(1)实验样品采集本实验所用乌鸫标本采自于四川省绵阳市梓潼县。(2)乌鸫总基因组DNA的提取取乌鸫腿部肌肉组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g放入1.5ml离心管中，剪碎备用，采用SDS-酚-氯仿-异戊醇抽提法提取总DNA；提取的乌鸫总DNA经琼脂糖凝胶电泳和电脑成像系统拍照，结果如图1。图1中字母T、M分别为Turdusmerula、Marker的缩写，代表乌鸫基因组和Marker所对应的条带，从图1中可以看出，条带T明亮清晰且大于15000bp，符合基因组扩增的片段长度，保存-20℃冰箱，备用；(3)引物设计和PCR基因扩增根据NCBI上现已提交的6个乌鸫近缘物种的mtDNA全基因组序列，使用Primer5.0设计12对可覆盖乌鸫mtDNA全序列的引物，如表1所示的序列；然后进行PCR反应，PCR反应总体积为25μL：基因组DNA(10ng/μL)2μL、LoadingBuffer2.5μL、MgCl22.0μL、dNTPs1.5μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、上下游引物(5μmol/L)各0.5μL、无菌水补足。PCR反应的参数为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸45-100s，35个循环；72℃终延伸7min，用琼脂糖凝胶电泳来检验DNA提取结果，结果如图3所示，图3中，T1-T12分别对应采用的所述12对引物，M为Marker的缩写；检验合格后将提取的基因样本保存于-20℃冰箱保存。表1乌鸫线粒体基因组扩增引物(4)测序、拼接及分析将所得样本送成都擎科生物技术公司进行序列测定，利用测的数据分析其线粒体全基因组的成分、基因的排列顺序和碱基组成特征。乌鸫线粒体基因组序列全长16734bp，其序列如SEQIDNO:1所示，其为环形双链DNA，包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA、2个rRNA基因片段，D-loop区(控制区)。乌鸫mtDNA编码的37个片段基因中，有9段基因(包括1个蛋白质编码基因和8个tRNA基因)由L链编码，其余皆由H链编码。它们的碱基组成为：C(32.50％)>A(29.34％)>T(23.34％)>G(14.82％)，A+T含量(52.68％)比C+G(47.32％)稍高，无明显的AT偏好性，符合鸟类线粒体基因组A+T(51.6％-55.7％)的比例，并且与其它鸫属此类数据相类似，例如斑鸫：A+T：52.79％、灰背鸫：A+T：52.62％等。乌鸫tRNAAsn和tRNACys基因之间无基因间隔，没有发现普遍存在于脊椎动物中的轻链复制起点(OL)。线粒体基因组序列包含8处重叠，共42bp(占全序列的0.25％)，其中最大重叠(10bp)分别位于12SrRNA与Val和ATP6与ATP8之间。基因间隔包含18处，共74bp(占全序列的0.44％)，间隔长度1-10bp不等，最大间隔(10bp)3处，分别位于Asp和COX2、ND5和Cytb、Pro和ND6之间。乌鸫线粒体基因组各基因位置、排列顺序如图3，基因组成见表2。表2乌鸫线粒体基因组特征用DNABaserAssembler和人工排查进行序列拼接，得到乌鸫线粒体基因组全序列。拼接结果利用BLAST进行同源性搜索，通过对比NCBI上前人所提交的鸫属其它鸟类的线粒体全基因组，确定乌鸫的13个蛋白质编码基因；用在线软件tRNAscan-SE在线软件(http://lowela本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乌鸫系统发育树的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集乌鸫标本；(2)乌鸫总基因组的提取从步骤(1)采集的乌鸫标本中提取乌鸫总DNA；(3)引物设计和PCR基因扩增设计可覆盖乌鸫mtDNA全序列的引物，然后采用所述引物对步骤(2)所得的总DNA，进行PCR扩增，扩增所得目的片段之间的重叠为100‑200bp，得到基因样本；(4)测序、拼接及分析将步骤(3)所得的基因样本进行测序，然后利用测得的数据分析其线粒体全基因组的成分、基因的排列顺序和碱基组成特征；再进行序列拼接，得到乌鸫线粒体基因组全序列，如SEQ ID NO:1所示；根据拼接得到的基因组全序列确定乌鸫的13个蛋白质编码基因；预测各tRNA的二级结构，并根据预测结果绘制；最后对线粒体全基因组、13个蛋白质编码基因、22个tRNA、2个rRNA和D‑loop进行特征分析；(5)构建系统发育树根据已知的鸟类的13个蛋白质编码基因，用白颊噪鹛和火尾希鹛13个蛋白质编码基因作为外群，去终止密码子后拼接，构建得到系统发育树。

【技术特征摘要】
1.一种乌鸫系统发育树的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集乌鸫标本；(2)乌鸫总基因组的提取从步骤(1)采集的乌鸫标本中提取乌鸫总DNA；(3)引物设计和PCR基因扩增设计可覆盖乌鸫mtDNA全序列的引物，然后采用所述引物对步骤(2)所得的总DNA，进行PCR扩增，扩增所得目的片段之间的重叠为100-200bp，得到基因样本；(4)测序、拼接及分析将步骤(3)所得的基因样本进行测序，然后利用测得的数据分析其线粒体全基因组的成分、基因的排列顺序和碱基组成特征；再进行序列拼接，得到乌鸫线粒体基因组全序列，如SEQIDNO:1所示；根据拼接得到的基因组全序列确定乌鸫的13个蛋白质编码基因；预测各tRNA的二级结构，并根据预测结果绘制；最后对线粒体全基因组、13个蛋白质编码基因、22个tRNA、2个rRNA和D-loop进行特征分析；(5)构建系统发育树根据已知的鸟类的13个蛋白质编码基因，用白颊噪鹛和火尾希鹛13个蛋白质编码基因作为外群，去终止密码子后拼接，构建得到系统发育树。2.根据权利要求1所述的乌鸫系统发育树的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，提取方法为SDS-酚-氯仿-异戊醇抽提法...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜立春，刘雷，张敏，
申请(专利权)人：绵阳师范学院，
类型：发明
国别省市：四川,51