一种真菌基因敲除双荧光筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，涉及真菌基因敲除技术领域，该方法包括扩增pYES2载体DNA模板中的2.9‑kb URA3‑2micro2_origin片段并将该片段插入pCAMBIA1300载体，获得pUM载体；然后分别扩增tef1启动子、eGFP基因、PgpdA启动子、ble抗性基因、RFP基因、TtrpC终止子、目标基因x的上游同源臂、目标基因x的下游同源臂；最终构建目标基因x的敲除载体pKO‑x；将pKO‑x转化入农杆菌感受态细胞，通过农杆菌介导方法转化真菌，先进行抗生素筛选，获得抗性转化子，将抗性转化子再进行荧光显微镜检测，若只发红色荧光，则为目标转化子，既有绿色荧光也有红色荧光者为异位整合的转化子，无荧光者为野生型；本发明专利技术提供的方法能够有效将目标转化子与异位整合的转化子区分开来。

A Double Fluorescence Screening Method for Fungal Gene Knockout

【技术实现步骤摘要】
一种真菌基因敲除双荧光筛选方法
本专利技术涉及一种真菌基因敲除
，尤其涉及一种真菌基因敲除高效筛选方法。
技术介绍
植物病原真菌常侵染水稻、小麦、玉米等重要农作物，给我国的农业产量及农作物品质造成严重危害。目前有关植物病原真菌致病分子机理的探究多涉及基因的功能分析，其中基因敲除是进行基因功能分析的重要手段，而涉及的遗传转化方法主要有两种：一是原生质体PEG转化法，此方法存在着原生质体制备过程复杂，重复性差，转化子不稳定，转化效率低等缺点。二是基于农杆菌介导的遗传转化方法，具有效率高，成本低，操作方便和重复性好等特点，为真菌的功能基因组研究提供了有力的工具；但通过农杆菌介导进行基因敲除存在着目标转化子筛选较为困难的问题，即很难将目标转化子与异位整合的转化子区分开来。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种真菌基因敲除高效筛选方法，以解决现有技术中难将目标转化子与异位整合的转化子区分开来的技术问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，该方法包括以下步骤：步骤1、扩增pYES2载体DNA模板中的2.9-kbURA3-2micro2_origin片段；步骤2、将步骤1扩增获得的片段插入pCAMBIA1300载体的SacII位点，获得pUM载体；步骤3、以黄曲霉菌基因组DNA为模板扩增tef1启动子、以eGFP基因为模板扩增eGFP基因、以pAN7-1载体为模板扩增PgpdA启动子、以pAF载体为模板扩增ble抗性基因、以RFP基因为模板扩增RFP基因、以pAN7-1载体为模板扩增TtrpC终止子、目标基因x的上游同源臂、目标基因x的下游同源臂；步骤4、将步骤2获取的pUM载体和步骤3获取的所有扩增片段一起转入酵母菌感受态细胞，在SC-U培养基上进行筛选培养，获得阳性转化子，提取转化子中的质粒，即为目标基因x的敲除载体pKO-x；步骤5、鉴定将步骤4获取的目标基因x的敲除载体pKO-x转化入农杆菌感受态细胞，通过农杆菌介导方法转化真菌，先进行抗生素筛选，获得抗性转化子，将获得的抗性转化子再进行荧光显微镜检测，若只发红色荧光，则为目标转化子，既有绿色荧光也有红色荧光者为异位整合的转化子，无荧光者为野生型。进一步，步骤1的具体操作为：设计如下引物：引物1：CCGCGGGGAACAACACTCAACCCTA；引物2：CCGCGGTTCGATGTAACCCACTCG；用引物1和引物2扩增并获取pYES2载体DNA模板中的2.9-kbURA3-2micro2_origin片段。3、根据权利要求1所述的一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，其特征在于，步骤3中获得tef1启动子的具体操作为：步骤3.1、获得tef1启动子设计如下引物：引物3：TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTATTGCCTCTTTGCCTCCTAACAG；引物4：GGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTTTGAAGGTGGTGCGAACTTTGTAG；以黄曲霉菌基因组DNA为模板，用引物3和引物4扩增，获得tef1启动子。进一步，步骤3中获得eGFP基因的具体操作为：步骤3.2、获得eGFP基因设计如下引物：引物5：ATGGTGAGCAAGGGCGAG；引物6：TTACTTGTACAGCTCGTCCATG；以eGFP基因为模板，用引物5和引物6扩增，获得eGFP基因。进一步，步骤3中获得PgpdA启动子的具体操作为：步骤3.3、获得PgpdA启动子设计如下引物：引物7：GAATTCCCTTGTATCTCTACAC；引物8：GGTGATGTCTGCTCAAGC；以pAN7-1载体为模板，用引物7和引物8扩增，获得PgpdA启动子。进一步，步骤3中获得ble抗性基因的具体操作为：步骤3.4、获得ble抗性基因设计如下引物：引物9：AACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGGCCAAGTTGACCAGTG；引物10：ACTTCCGCTACCACCGTCCTGCTCCTCGGCCAC；以pAF载体为模板，用引物9和引物10扩增，获得ble抗性基因。进一步，步骤3中获得RFP基因的具体操作为：步骤3.5、获得RFP基因设计如下引物：引物11：GGTGGTAGCGGAAGTATGGTGAGCAAGGGCGAG；引物12：AGCTGTTTGATGATTTCAGTAACGTTAAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG；以RFP基因为模板，用引物11和引物12扩增，获得RFP基因。进一步，步骤3中获得TtrpC终止子的具体操作为：步骤3.6、获得TtrpC终止子设计如下引物：引物13：ACTTAACGTTACTGAAATCATC；引物14：GTCGAGTGGAGATGTGGAG；以pAN7-1载体为模板，用引物13和引物14扩增，获得TtrpC终止子。进一步，步骤3中获得目标基因x的上游同源臂的具体操作为：步骤3.7、获得目标基因x的上游同源臂设计如下引物：引物15：GGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGGATCC+20～30bp目标基因x上游同源臂的5’端序列；引物16：CAATAAGGAGCTTACTCCTCCTTGACACCA+20～30bp目标基因x上游同源臂的3’端序列；以目标基因x的DNA为目标，用引物15和引物16扩增，获得目标基因x的上游同源臂。进一步，步骤3中获得目标基因x的上游同源臂的具体操作为：步骤3.8、获得目标基因x的下游同源臂设计如下引物：引物17：GTAAGCGCCCACTCCACATCTCCACTCGAC+20～30bp目标基因x下游同源臂的5’端序列；引物18：TAAACGCTCTTTTCTCTTAGGTTTACCCGC+20～30bp目标基因x下游同源臂的3’端序列；以目标基因x的DNA为目标，用引物17和引物18扩增，获得目标基因x的下游同源臂。本专利技术相比现有技术具有以下优点：1、本专利技术将绿色荧光蛋白置于tef1启动子下，构建成一个表达盒；筛选标记基因和红色荧光报告基因融合，置于gpdA强启动子下，构建在一个表达盒中，以上两个表达盒串联在T-DNA区，本专利技术构建的载体，有利于通过农杆菌介导法进行knockout基因功能分析。达到阳性转化子的筛选鉴定，减轻工作量，可省略southernblot(印迹杂交)验证环节。2、含红色荧光的黄曲霉菌可作为研究黄曲霉菌与宿主细胞相互作用的工程菌。红色荧光在活细胞成像中具有以下优点：一是在多种颜色成像实验中需要红色探针，二是红色荧光较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织。所以它能很好地追踪黄曲霉菌的侵染过程而又不伤害宿主细胞，为这一危害人类健康的产毒真菌的防治提供依据。3、本专利技术构建的载体除可用于黄曲霉菌外，其它可以ble基因为筛选标记基因的真菌也可利用该载体进行遗传转化研究。附图说明图1为实施例1构建的pUM载体示意图；图2为pKO-x载体构建过程示意图。图3为荧光显微镜检测筛选不同结果图。具体实施方式下面，举实施例说明本专利技术，但是，本专利技术并不限于下述的实施例。本实施例适用于对博莱霉素敏感的真菌，黄曲霉菌NRRL3357为全本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤1、扩增pYES2载体DNA模板中的2.9‑kb URA3‑2micro2_origin片段；步骤2、将步骤1扩增获得的片段插入pCAMBIA1300载体的Sac II位点，获得pUM载体；步骤3、以黄曲霉菌基因组DNA为模板扩增tef1启动子、以eGFP基因为模板扩增eGFP基因、以pAN7‑1载体为模板扩增PgpdA启动子、以pAF载体为模板扩增ble抗性基因、以RFP基因为模板扩增RFP基因、以pAN7‑1载体为模板扩增TtrpC终止子、目标基因x的上游同源臂、目标基因x的下游同源臂；步骤4、将步骤2获取的pUM载体和步骤3获取的所有扩增片段一起转入酵母菌感受态细胞，在SC‑U培养基上进行筛选培养，获得阳性转化子，提取转化子中的质粒，即为目标基因x的敲除载体pKO‑x；步骤5、鉴定将步骤4获取的目标基因x的敲除载体pKO‑x转化入农杆菌感受态细胞，通过农杆菌介导方法转化真菌，先进行抗生素筛选，获得抗性转化子，将获得的抗性转化子再进行荧光显微镜检测，若只发红色荧光，则为目标转化子，既有绿色荧光也有红色荧光者为异位整合的转化子，无荧光者为野生型。...

【技术特征摘要】
1.一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤1、扩增pYES2载体DNA模板中的2.9-kbURA3-2micro2_origin片段；步骤2、将步骤1扩增获得的片段插入pCAMBIA1300载体的SacII位点，获得pUM载体；步骤3、以黄曲霉菌基因组DNA为模板扩增tef1启动子、以eGFP基因为模板扩增eGFP基因、以pAN7-1载体为模板扩增PgpdA启动子、以pAF载体为模板扩增ble抗性基因、以RFP基因为模板扩增RFP基因、以pAN7-1载体为模板扩增TtrpC终止子、目标基因x的上游同源臂、目标基因x的下游同源臂；步骤4、将步骤2获取的pUM载体和步骤3获取的所有扩增片段一起转入酵母菌感受态细胞，在SC-U培养基上进行筛选培养，获得阳性转化子，提取转化子中的质粒，即为目标基因x的敲除载体pKO-x；步骤5、鉴定将步骤4获取的目标基因x的敲除载体pKO-x转化入农杆菌感受态细胞，通过农杆菌介导方法转化真菌，先进行抗生素筛选，获得抗性转化子，将获得的抗性转化子再进行荧光显微镜检测，若只发红色荧光，则为目标转化子，既有绿色荧光也有红色荧光者为异位整合的转化子，无荧光者为野生型。2.根据权利要求1所述的一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，其特征在于，步骤1的具体操作为：设计如下引物：引物1：CCGCGGGGAACAACACTCAACCCTA；引物2：CCGCGGTTCGATGTAACCCACTCG；用引物1和引物2扩增并获取pYES2载体DNA模板中的2.9-kbURA3-2micro2_origin片段。3.根据权利要求1所述的一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，其特征在于，步骤3中获得tef1启动子的具体操作为：步骤3.1、获得tef1启动子设计如下引物：引物3：TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTATTGCCTCTTTGCCTCCTAACAG；引物4：GGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTTTGAAGGTGGTGCGAACTTTGTAG；以黄曲霉菌基因组DNA为模板，用引物3和引物4扩增，获得tef1启动子。4.根据权利要求3所述的一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，其特征在于，步骤3中获得eGFP基因的具体操作为：步骤3.2、获得eGFP基因设计如下引物：引物5：ATGGTGAGCAAGGGCGAG；引物6：TTACTTGTACAGCTCGTCCATG；以eGFP基因为模板，用引物5和引物6扩增，获得eGFP基因。5.根据权利要求4所述的一种真菌基因敲除双荧光筛选方法，其特征在于，步骤3中获得PgpdA启动子的具体操作为：步骤3.3、获得PgpdA启动子设计如下引物：引...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶芳，赵凯，项芳芝，赵倩倩，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34