一种脑靶向外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种脑靶向外泌体及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：(1)将干细胞在低氧条件下进行培养，对干细胞进行靶向修饰；所述的低氧条件为：温度为30～40℃，氧气浓度为0.5～5％，二氧化碳浓度为1～10％；(2)将靶向修饰后的干细胞转移至正常培养条件进行培养，收集干细胞培液，从所述的干细胞培液中提取分离，获得脑靶向外泌体。获得的脑靶向外泌体可应用于制备治疗缺血性脑卒中的药物。本发明专利技术的制备方法通过对干细胞的改造间接修饰外泌体，提高其膜表面CXCR4的表达，从而提高其脑靶向性。

A brain-targeting exosome and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种脑靶向外泌体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物载体靶向递药
，尤其涉及一种脑靶向外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
近年来随着全球环境的变化和人类生活方式的转变，心脑血管疾病逐渐占据了人类致死原因的首位。其中，中国每年新发生脑血管病约340万，新出现脑血管病死亡约为160万，发病率和死亡率还在逐年上升。缺血性脑卒中具有高发病率、高致死率、高致残率的特点。最常见的缺血性脑卒中是由于大脑的供血动脉狭窄或闭塞，颅内血液循环障碍而导致的局部脑组织缺血缺氧坏死，最终产生神经功能和运动功能障碍，给患者及其家庭带来了巨大的身心痛苦和经济负担，严重的阻碍了社会发展。近年来，干细胞移植在多种脑部疾病的治疗中表现出很好的治疗效果。研究发现，干细胞在移植进入体内后能迁移到病变部位，一方面通过自身分化潜能在脑部疾病区域分化为神经细胞，另一方面也会分泌神经营养因子，调节疾病微环境，促进自身干细胞迁移至损伤组织进行修复和再生，在脑部疾病的治疗中展现了巨大的潜能。但干细胞的移植治疗还存在一定的风险性。而外泌体作为细胞间信息传输的一种重要囊泡，由于其低免疫原性，高生物相容性，结构稳定、安全，容易穿过体内屏障等优点，有潜力成为一种基于细胞、具有其优点又能兼具安全性和可修饰性的药物载体。同时外泌体内包含其亲源细胞内的蛋白质、脂质、基因等内容物，也可以对疾病产生一定的治疗作用。外泌体的靶向性与其亲源细胞相关，靶向能力较弱。这会导致提取困难的外泌体在使用中的浪费，影响疗效。因此，外泌体的靶向性需要提高。干细胞膜表面有趋化因子SDF-1的受体CXCR4表达。SDF-1在正常脑组织中表达较低，但在缺氧和炎症区域表达上调。它能引导干细胞迁移到损伤区域进行修复治疗，是干细胞靶向能力的重要组成部分。由于外泌体的膜结构部分来源于细胞膜，细胞膜上蛋白受体的变化也可以转移到外泌体上。通过对干细胞的修饰来提高外泌体表面的CXCR4表达，从而有效提高外泌体的脑靶向性。因此，修饰外泌体使之成为脑靶向生物载体对缺血性脑卒中的治疗具有很好的应用前景及重要的科学意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种脑靶向外泌体的制备方法，通过对干细胞的改造间接修饰外泌体，提高其膜表面CXCR4的表达，从而提高其脑靶向性。具体技术方案如下：一种脑靶向外泌体的制备方法，包括以下步骤：(1)将干细胞在低氧条件下进行培养，对干细胞进行靶向修饰；所述的低氧条件为：温度为30～40℃，氧气浓度为0.5～5％，二氧化碳浓度为1～10％；(2)将靶向修饰后的干细胞转移至正常培养条件进行培养，收集干细胞培液，从所述的干细胞培液中提取分离，获得脑靶向外泌体。所述的正常培养条件为：温度为30～40℃，氧气浓度为15～20％，二氧化碳浓度为1～10％。经低氧条件培养后，干细胞不会表现出明显毒性，并且干细胞及其分泌的外泌体膜表面CXCR4表达量增加最为显著，且对干细胞的外泌体分泌能力没有明显影响，外泌体形态完整，不被破坏。而CXCR4为趋化因子SDF-1的受体，SDF-1在正常脑组织中表达较低，但在缺氧和炎症区域表达上调，因此，CXCR4能引导干细胞迁移到损伤区域进行修复治疗，是干细胞靶向能力的重要组成部分。通过对干细胞的修饰来提高外泌体表面的CXCR4表达，从而有效提高外泌体的脑靶向性。低氧培养时，氧气浓度过高无法对干细胞产生明显的低氧刺激效果，氧气浓度过低会影响细胞活性。优选的，所述的低氧条件为：温度为30～40℃，氧气浓度为0.5～2％，二氧化碳浓度为3～6％。优选的，将干细胞在低氧条件下进行培养4～36h。随着低氧培养时间的增长，外泌体CXCR4表达逐渐提高，且在低氧培养24h后有显著差异，在低氧培养24h后，外泌体CXCR4表达显著超过正常培养组。进一步优选的，将干细胞在低氧条件下进行培养12～24h。具体的，步骤(1)中，将干细胞重悬在培养液中，制得细胞悬液；所述的细胞悬液中，干细胞的浓度为104～107cell/mL。干细胞浓度过高不利于细胞存活，影响细胞活性。浓度过低不利于细胞存活，且难以收集足够的外泌体。优选的，所述的细胞悬液中，干细胞的浓度为1×105～5×105cell/mL。所述的培养液为包含2％的细胞培养添加剂B27、1μg/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、2μg/mL表皮细胞生长因子(EGF)的DMEM/F12培养液。步骤(2)中，从所述的干细胞培液中提取分离，获得脑靶向外泌体，包括：将干细胞陪液离心，取上清液；再将所述上清液超滤浓缩，浓缩液采用外泌体分离柱过柱分离，获得脑靶向外泌体。所述的离心、浓缩包括：先将干细胞培液通过3000g离心30min，取上清液；再将上清液10000g离心30min，取上清液用100KD超滤管以4000g的速度离心浓缩。所述的外泌体分离柱为qEV细胞外囊泡(外泌体)分离柱。本专利技术还提供了上述制备方法制得的脑靶向外泌体，该脑靶向外泌体可应用于制备治疗缺血性脑卒中的药物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术的制备方法不会对干细胞表现出明显毒性，对干细胞的外泌体分泌能力没有明显影响；(2)制得的外泌体膜表面CXCR4表达量增加显著，脑靶向能力显著提高，增强了外泌体在缺血性脑卒中坏死脑域的聚集；(3)对外泌体的膜修饰过程不涉及对外泌体的破坏，能最大限度保持外泌体膜的完整性，保护其有治疗效果的内容物不流失；(4)制备方法操作简单，便于控制。附图说明图1为未低氧培养的干细胞分泌的外泌体透射电镜图；图2为低氧培养后的干细胞分泌的外泌体透射电镜图；图3为低氧培养后干细胞及其分泌的外泌体CXCR4表达量变化；其中(a)为外泌体(exosomes)总蛋白量变化，(b)为干细胞(NSCs)总蛋白量变化，(c)为外泌体的CXCR4总量变化，(d)为干细胞的CXCR4总量变化，(e)为外泌体的CXCR4相对蛋白量变化，(f)为干细胞的CXCR4相对蛋白量变化，*、**分别代表P＜0.05、P＜0.01；图4为外泌体在MCAO小鼠体内分布情况；其中(a)为未低氧培养的干细胞分泌的外泌体，(b)为低氧培养后的干细胞分泌的外泌体；图5为干细胞及其分泌的外泌体对缺血性脑卒中小鼠治疗的效果图；其中MCAO组为小鼠MCAO造模后不治疗，NSC组为小鼠MCAO造模后尾静脉注射低氧培养后的NSCs进行治疗；Exosomes组为小鼠MCAO造模后尾静脉注射低氧培养后的NSCs分泌的外泌体进行治疗。具体实施方式1、干细胞分泌的外泌体的提取分离将干细胞重悬在培养液中，制得细胞悬液(2×105cell/mL)，于37℃、正常条件(氧气浓度为20％，二氧化碳浓度为5％)中培养48h。培养液包含基础培养液DMEM/F12(Gibco，货号11330032)、2％的细胞培养添加剂B27(Gibco，货号17504-044)、1μg/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，PeproTech，货号450-33-50)、2μg/mL表皮细胞生长因子(EGF，PeproTech，货号315-09-100)。收集干细胞培液，低速离心，通过3000g离心30min，取上清液；再通过10000g离心30min，取上清液，弃去细胞碎片及细胞器等沉淀物。将离心后的细胞培液用100KD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脑靶向外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将干细胞在低氧条件下进行培养，对干细胞进行靶向修饰；所述的低氧条件为：温度为30～40℃，氧气浓度为0.5～5％，二氧化碳浓度为1～10％；(2)将靶向修饰后的干细胞转移至正常培养条件进行培养，收集干细胞培液，从所述的干细胞培液中提取分离，获得脑靶向外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种脑靶向外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将干细胞在低氧条件下进行培养，对干细胞进行靶向修饰；所述的低氧条件为：温度为30～40℃，氧气浓度为0.5～5％，二氧化碳浓度为1～10％；(2)将靶向修饰后的干细胞转移至正常培养条件进行培养，收集干细胞培液，从所述的干细胞培液中提取分离，获得脑靶向外泌体。2.根据权利要求1所述的脑靶向外泌体的制备方法，其特征在于，所述的低氧条件为：温度为30～40℃，氧气浓度为0.5～2％，二氧化碳浓度为3～6％。3.根据权利要求1所述的脑靶向外泌体的制备方法，其特征在于，将干细胞在低氧条件下进行培养4～36h。4.根据权利要求3所述的脑靶向外泌体的制备方法，其特征在于，将干细胞在低氧条件下进行培养12～24h。5.根据权利要求1所述的脑靶向外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将干细胞重悬在培养液中，制得细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：高建青，蒋心驰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33