银纳米簇基复合材料的制备方法以及基于该复合材料的核酸检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种银纳米簇基复合材料的制备方法以及基于该复合材料的核酸检测方法。本发明专利技术提供的银纳米簇基复合材料的制备方法，通过与土伦试剂反应，最终形成低聚团簇和银纳米粒子胶体，有效解决银纳米簇易聚集的问题。本发明专利技术提供的核酸检测方法，基于CHA反应，一个靶序列促进多组发夹结构H2链与发夹结构H1链结合，每个发夹结构H2链预先由一个标签1标定，形成H1‑H2功能化的磁珠后，再结合标签2功能化的酶分子，通过酶分子催化底物生成过氧化氢以催化银纳米簇基复合材料反应即可判定靶序列的含量，提高了核酸检测的灵敏度。

Preparation of Ag nanocluster matrix composites and nucleic acid detection method based on the composites

【技术实现步骤摘要】
银纳米簇基复合材料的制备方法以及基于该复合材料的核酸检测方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种银纳米簇基复合材料的制备方法以及基于该复合材料的核酸检测方法。
技术介绍
近年来，纳米技术在生物/化学传感、生物分子标记、纳米药物输送、纳米电子传感等应用领域已取得显著的突破，在生物检测分析领域，贵金属纳米簇复合材料因具有良好的生物相容性、光稳定性和发光效率等突出性质而成为研究的热点。量子点(QuantumDots，QDs)，是一种半径小于或接近激子波尔半径、能够接受激发光产生荧光的半导体纳米材料。量子点具有很好的光稳定性以及宽的激发谱和窄的发射谱，而且生物相容性好，量子点经过各种化学修饰后可进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，从而使其在生物成像、生物传感、电化学催化等领域有着广泛的应用前景。现知的人类疾病都与基因有着直接或间接的关系，核酸的检测和分析在遗传性疾病、传染病和肿瘤等领域的应用日益广泛。有文献报道，银纳米簇基量子点复合材料因具有低毒性和潜在的杀菌活性而应用于核酸的检测，但是现有的银纳米簇基量子点复合材料在合成制备、材料性能(如稳定性、还原性)以及检测效果等方面还不尽人意，如哈立德等人合成了聚乙二醇GQD/AgNCs复合材料，但因其合成工艺苛刻、耗时，限制了其应用。而且，银纳米簇基复合材料的结构影响着核酸检测的准确性和灵敏度，现有技术公开的银纳米簇基复合材料的核酸检测技术还处于探索阶段。因此，提供一种新型的银纳米簇基复合材料并以此建立一种高效、灵敏、方便的核酸检测方法将具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有的银纳米簇基复合材料因其制备困难、材料性能差从而不适于核酸检测的缺陷，从而提出一种新型的银纳米簇基复合材料以及基于此复合材料的高效、灵敏、方便的核酸检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供的一种银纳米簇基复合材料的制备方法，包括以下步骤：步骤(i)，向量子点材料中性溶液中加入土伦试剂，室温混合0.1～10小时，制备得到反应原液；步骤(ⅱ)，将步骤(i)所述反应原液在40～110℃加热0.1～10小时，降至室温，制备得到所述银纳米簇基复合材料。优选地，该银纳米簇基复合材料的制备方法，所述量子点材料的选自碳基量子点、半导体量子点中的至少一种。本专利技术还提供一种利用上述银纳米簇基复合材料进行核酸检测的方法，包括以下步骤：步骤(1)，根据靶序列设计与所述靶序列互补的发夹结构H1链以及与所述发夹结构H1链序列互补的发夹结构H2链；步骤(2)，将步骤(1)中的所述发夹结构H1链负载在磁珠上，得到H1链功能化的磁珠；步骤(1)中的所述发夹结构H2链标记有以与酶分子结合的功能化标签1，得到标签1标记的H2链；步骤(3)，先将所述靶序列与所述H1链功能化的磁珠混合，再加入所述标签1标记的H2链，所述靶序列催化所述标签1标记的H2链与所述H1链功能化的磁珠结合，然后磁分离，弃上清液，用缓冲液复溶，得到H1-H2双链功能化的磁珠；步骤(4)，向步骤(3)得到的所述H1-H2双链功能化的磁珠缓冲液中加入标签2功能化的所述酶分子，孵育，得到酶-磁珠复合物；步骤(5)，将权利要求1或2所述的银纳米簇基复合材料、所述酶分子以及步骤(4)中制备得到的所述酶-磁珠复合物混合，通过比色或荧光分析判断所述靶序列的浓度；其中，所述标签1和所述标签2为是以通过共价键或、结构特异性识别或主-客体相互作用任一方式特异性结合的一对分子标签；所述标签1和标签2所构成的分子对选自生物素与链霉亲和素、氨基与羧基、抗原与抗体、适体与配体中的任一对。优选地，该方法的步骤(1)中，对所述发夹结构H1链和所述发夹结构H2链进行预处理：将所述发夹结构H1链和所述发夹结构H2链分别溶解于缓冲液中，40～100℃加热，加热时间不长于100分钟，之后降至室温。优选地，该方法的步骤(2)中，所述H1链功能化的磁珠的制备方法为：将所述发夹结构H1链加至磁珠溶液中进行至少一次孵育。进一步优选地，该方法中，所述孵育的温度不高于100℃，所述孵育时间不长于40小时。进一步优选地，该方法的步骤(3)中，所述混合的温度不高于100℃，所述混合的时间不长于20小时。进一步优选地，该方法的步骤(4)中，所述孵育的温度不高于100℃，所述混合的时间为不长于10小时。进一步优选地，所述酶分子为氧化酶或还原酶以与所述底物氧化或还原并产生过氧化氢分子，所述酶分子选自葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、葡萄糖脱氢酶、多胺氧化酶、超氧化物歧化酶中的至少一种。优选地，该方法用于病毒RNA、microRNA、ctDNA核酸序列的检测。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的银纳米簇基复合材料的制备方法，向量子点材料中性溶液中加入土伦试剂，室温混合0.1～10小时，然后40～110℃加热0.1～10小时，降温，制备得到银纳米簇基复合材料。在上述制备过程中，室温混合促使Ag(NH3)3+在静电作用下吸附在量子点材料表面；高温加热促进Ag(NH3)3+在量子点材料表面形成Ag(NH3)2，并使得Ag(NH3)2在游离NH3分子作用下保持暂时稳定的状态，然后趋于形成低聚团簇和银纳米粒子胶体。该银纳米簇基复合材料体系，银纳米粒子胶体还能促进量子点材料发生还原反应，以使得银纳米粒子在量子点材料表面原位生长，有效解决了银纳米簇易于聚集的问题。2.本专利技术提供的利用银纳米簇基复合材料进行核酸检测的方法，利用发夹结构H1链分别与靶序列和发夹结构H2链结合能力的差异，先通过靶序列与发夹结构H1链结合，降低发夹结构H1链与发夹结构H2链列结合的势能，然后催化发夹结构H2链与发夹结构H1链的结合，基于CHA反应，能够通过检测发夹结构H2含量即能实现对靶序列含量的检测，简单便捷。被置换的靶序列继续催化下一组发夹结构H2链与发夹结构H1链结合，从而实现一个靶序列催化多组发夹结构H2链与发夹结构H1链的结合，最终达到发夹结构H2链与所有发夹结构H1链互补的目的，也即，靶序列对应着多个发夹结构H2链，靶序列的检测由多个发夹结构H2链的信息来体现，实现了靶序列信号的放大，提高了检测的准确性；每个发夹结构H2链预先由一个标签1标定，形成H1-H2功能化的磁珠后，再结合标签2功能化的酶分子，通过酶分子催化底物生成过氧化氢以催化银纳米簇基复合材料反应，通过酶分子催化底物生成过氧化氢以催化银纳米簇基复合材料反应即可判定靶序列的含量，提高了核酸检测的灵敏度。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例2提供的检测方法原理示意图；图2为石墨烯量子点(GQD)、实施例1提供的银纳米簇基复合材料(GQD/AgNCs)的电镜扫描图；图3为本专利技术实施例2提供的CHA反应原理紫外可见光谱验证图；图4为本专利技术实施例2提供的靶序列HCVRNA检测线性范围示意图；图5为本专利技术实施例2提供的检测特异性与选择性对照图。具体实施方式为了便于理解本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种银纳米簇基复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(i)，向量子点材料中性溶液中加入土伦试剂，室温混合0.1～10小时，制备得到反应原液；步骤(ⅱ)，将步骤(i)所述反应原液在40～110℃加热0.1～10小时，降至室温，制备得到所述银纳米簇基复合材料。

【技术特征摘要】
1.一种银纳米簇基复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(i)，向量子点材料中性溶液中加入土伦试剂，室温混合0.1～10小时，制备得到反应原液；步骤(ⅱ)，将步骤(i)所述反应原液在40～110℃加热0.1～10小时，降至室温，制备得到所述银纳米簇基复合材料。2.根据权利要求1所述的银纳米簇基复合材料的制备方法，其特征在于，所述量子点材料的选自碳基量子点、半导体量子点中的至少一种。3.一种利用权利要求1或2所述的银纳米簇基复合材料进行核酸检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)，根据靶序列设计与所述靶序列互补的发夹结构H1链以及与所述发夹结构H1链序列互补的发夹结构H2链；步骤(2)，将步骤(1)中的所述发夹结构H1链负载在磁珠上，得到H1链功能化的磁珠；步骤(1)中的所述发夹结构H2链标记有以与酶分子结合的功能化标签1，得到标签1标记的H2链；步骤(3)，先将所述靶序列与所述H1链功能化的磁珠混合，再加入所述标签1标记的H2链，所述靶序列催化所述标签1标记的H2链与所述H1链功能化的磁珠结合，然后磁分离，弃上清液，用缓冲液复溶，得到H1-H2双链功能化的磁珠；步骤(4)，向步骤(3)得到的所述H1-H2双链功能化的磁珠缓冲液中加入标签2功能化的所述酶分子，孵育，得到酶-磁珠复合物；步骤(5)，将权利要求1或2所述的银纳米簇基复合...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩坤，李夷飞，李靖雯，蒋平，翟星帏，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32