一种苏云金芽孢杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种苏云金芽孢杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用。该苏云金芽胞杆菌命名为CS72‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年12月27日，保藏编号为CCTCC NO.M2018930。该菌株对对鳞翅目产生毒力，尤其是玉米螟和棉铃虫有一定的毒杀作用。本发明专利技术还提供了一种新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以应用于植物的遗传改造，提高其对害虫的抗性，具有较好的生物防治作用，丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源。本发明专利技术提供的杀虫剂制备方法简单，易于工业化生产，防治效果良好，具有良好的开发应用前景。

Bacillus thuringiensis and its application in the control of Lepidoptera pests

【技术实现步骤摘要】
一种苏云金芽孢杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用
本专利技术属于生物防治
，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用。
技术介绍
在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽胞杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽胞形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididalcrystalproteins，简称ICPs)，ICPs主要由cry和cyt基因编码，具有特异的杀虫活性，cyt类杀虫晶体蛋白发现了3类，分别是cyt1类、cyt2类和cyt3类，cyt类蛋白中，第一等级蛋白共3类，其中最多的一类为cyt2类，共25个蛋白，cyt类蛋白分子量一般在27～30kDa。Bt具有高效专一、无毒、不污染环境等特点，被广泛作为微生物杀虫剂应用在农林、果蔬以及卫生等害虫防治，近年来Bt杀虫晶体蛋白编码基因已大量应用在转基因玉米、棉花、大豆等农作物中，取得了良好的防治效果。自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类。最近研究表明，cyt类蛋白可能成为控制害虫对cyt类杀虫晶体蛋白产生抗性的一种新策略，因为它与广泛应用的cry类蛋白相比，具有不同的蛋白结构和独特的作用机制。它除了具有杀虫特性以外，还具有在体外广泛溶细胞的能力。这些特性使它成为控制害虫对苏云金杆菌的cry类毒素蛋白的抗性的一种最有潜力的毒蛋白。此外，Federici发现cyt1Aa不但对棉花叶甲(Chrysomelascripa)有较高的毒性,而且可以抑制此叶甲对Cry3Aa的抗性达5000倍。可见，苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Btsubsp.kurstaikHD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik,B.E.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994；91:4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题,但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现。由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险。因此，寻找新的cyt基因资源对我国的生物防治有着十分重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种苏云金芽胞杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用，该菌株可有效毒杀农作物中的鳞翅目类害虫，且不会对农作物产生不利影响。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术提供了一种苏云金芽胞杆菌，该菌株命名为CS72-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年12月27日，保藏编号为CCTCCNO.M2018930。本专利技术还提供了上述苏云金芽胞杆菌CS72-2在防治鳞翅目类害虫中的应用。进一步地，鳞翅目类害虫为玉米螟或棉铃虫。本专利技术还提供了一种杀虫蛋白cyt2-like，该杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。本专利技术还提供了一种杀虫基因cyt2-like，可编码权利要求4所述杀虫蛋白cyt2-like，其核苷酸序列如SEQIDNO：1。本专利技术还提供了一种杀虫剂，包括上述苏云金芽胞杆菌CS72-2的培养菌悬液、发酵液或发酵分离上清液。本专利技术提供的苏云金芽胞杆菌及其在防治鳞翅目类害虫中的应用，具有以下有益效果：(1)本专利技术提供的苏云金芽胞杆菌CS72-2，通过产生杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有较高的毒力，尤其能抑制玉米螟和棉铃虫的生长和侵染。(2)本专利技术筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，该基因表达的蛋白能够对鳞翅目产生毒力，尤其是玉米螟和棉铃虫有一定的毒杀作用，可以应用于植物的遗传改造，提高其对害虫的抗性，具有较好的生物防治作用。本专利技术丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险。(3)本专利技术提供的杀虫剂，具有制备简单，成本低，易于工业化生产，防治效果良好，扩大了苏云金芽胞杆菌杀虫剂的使用范围，且不会造成环境污染，降低农药的使用量，具有重要的经济价值和应用前景。附图说明图1为CS72-2菌株的电镜扫描图。图2为CS72-2菌株SDS-PAGE电泳分析结果图；其中，M为蛋白质Marker；1为CS72-2菌株表达的蛋白。图3为CS72-2菌株中cyt基因型的PCR鉴定结果图；其中M为DNAMarker，2、3、4、5和6为cyt2类基因扩增产物。图4为CS72-2菌株中cyt2-like基因的PCR扩增产物；其中，M为DNAmarker，1为cyt2-like基因。具体实施方式实施例1苏云金芽胞杆菌CS72-2的分离筛选及鉴定1、分离筛选从贵州省高原地区采取土壤，采用醋酸钠－抗生素分离法进行分离，具体过程为：称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苏云金芽胞杆菌，命名为CS72‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年12月27日，保藏编号为CCTCC NO.M2018930。

【技术特征摘要】
1.一种苏云金芽胞杆菌，命名为CS72-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年12月27日，保藏编号为CCTCCNO.M2018930。2.如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌在防治鳞翅目类害虫中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鳞翅目类害虫为玉米螟或棉铃虫。4.一种杀虫蛋白cyt2-like，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6...

【专利技术属性】
技术研发人员：江波，郑爱萍，孙宏伟，马丽，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆,50