检测生物样品中的遗传物质的方法及其实施设备技术

本发明专利技术的目的是检测生物样品中遗传物质的方法，其中在将反应盒(6)置于控制设备中之后或之前，将生物样品加载至反应盒(6)中，将收集的生物样品带至取分离室(7)中，通过加热分离室(7)从测试样品中分离生物材料，将经分离的遗传物质移入多个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，通过加热反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)来扩增遗传物质，用于遗传物质扩增的冻干的试剂连同嵌入遗传物质的冻干的荧光标签存在于反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)中，以及与遗传物质扩增阶段一起进行来自荧光标签的信号检测。

Detection of genetic material in biological samples and its implementation equipment

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测生物样品中的遗传物质的方法及其实施设备本专利技术的目的是检测生物材料样品中的遗传物质(包括DNA和RNA)的方法，尤其是使用用于扩增遗传物质的LAMP技术(环介导等温扩增)及其实施设备。本专利技术的目的是用于快速且移动检测所获得的生物材料中的细菌、病毒和真菌病原体。目前，需要快速、廉价和有效的诊断方法来鉴定可能是如食品的微生物污染物中的细菌、病毒和真菌病原体。美国专利申请US2009061450A1公开了用于诊断和测定呼吸病原体的设备，包括鼻采样设备、用于靶核酸扩增的单入口一次性微流体盒以及具有机载测定控制平台和靶标检测装置的仪器。用于采样的设备是将样品载体放置在微流体盒中的适当插座中，使得它们彼此密封地且流体地连接。在微流体盒中可以区分许多腔室，其中进行病原体测定方法的后续步骤，其中第一阶段包括从测试样品中分离遗传物质，然后将经分离的材料扩增并进行检测。在引用的解决方案的一个实施方案种，遗传物质的扩增使用LAMP方法实现。在其中发生扩增的反应室中，有必要提供经设定且稳定的温度，其在所呈现的解决方案中通过印刷在微流体设备上的ITO加热元件实现。在进行遗传物质扩增之后添加嵌入遗传物质的荧光标签，从而进行实时光学检测。而美国专利申请US2012264132A1公开了处理样品的设备和方法，包括基本上等温扩增的核酸。根据所引用的专利技术的设备包括具有第一群体区域的第一基板(所述第一群体的至少一个区域具有至少一个设置在至少一个区域附近的卫星区域)，和至少一个适于保留来自第一区域的材料的卫星区域。设备另外包括其中形成有第二群体区域的第二基板，所述第一和第二基板彼此啮合使得第一和第二基板之间的相对运动将第一群体区域中的至少一些与第二群体区域中的至少一些对齐，使得它们彼此流体连通。使用所提及的设备扩增遗传物质包括使设置在多个第一区域中的样品材料(所述样品材料包含核酸靶标并且第一区域中的至少一个含有一个核酸靶分子)与设置在多个第二区域中的反应物材料接触，所述接触通过将至少一些第一区域和至少一些第二区域成对放置成彼此直接流体连通来实现。所述材料的接触实现了核酸靶分子的扩增。美国专利申请US20140335527A1公开了用于移动分析核酸和蛋白质的系统和方法。移动分析系统是一种小型无线设备，经由显示器和键盘与使用的设备进行通信。移动分析系统使用连接模块从样品中提取、扩增和检测核酸。整个过程与数据处理一起通常费时不超过20分钟。在遗传物质的分析方法的第一阶段中，将生物样品加载至集成芯片上。生物样品的加载可以通过样品进入口或通过自动采样手动完成。在集成芯片中，将样品输送到提取模块，在该提取模块中进行从生物样品中提取遗传物质的过程。然后将经分离的核酸输送至扩增模块，其中在一个实施方案中使用LAMP方法进行扩增。提取和扩增方法含有进行它们所需的所有试剂。扩增需要保持设定的温度升高，这可以通过红外线加热元件来实现。经扩增的遗传物质进入检测模块，在所述检测模块中例如通过来源于附接至经检测的DNA的适当标签的荧光信号来检测它。因此，遗传物质扩增的腔室中的一个可预加载有如荧光标记的LAMP主混合物。整个集成芯片是透明的，允许光束传输以加热各个模块并检测荧光信号。要解决的技术问题是提供检测生物材料样品中的遗传物质(尤其是DNA和/或RNA)的方法及其实施设备，其允许快速检测优选的病原体，同时，设备将易于制造、完整、可移动、制造相对便宜并且将允许反应盒长时间存储且不会与特定的储存条件如非常低的温度相关。对于作为用于检测生物材料样品中的病原体的设备的一部分的反应盒也优选的是适用于处理并且设备本身具有有限的能量消耗。此外，优选的是，所开发的病原体检测方法减少了所需的步骤数，使得实施更简单和更快，并且用于其实施的设备的构造提供了降低的生物材料样品污染风险。令人惊讶的是，上述问题已通过所示专利技术解决。本专利技术的第一个目的是检测生物样品中遗传物质的方法，其包括以下阶段：a)在将反应盒置于测量设备中之后或之前，将生物样品加载至反应盒中b)将收集的生物样品带至取分离室中，c)通过加热分离室从测试样品中分离生物材料，d)将经分离的遗传物质移入多个反应室，e)通过加热反应室来扩增遗传物质，其特征在于在至少一个反应室内部存在用于遗传物质扩增的冻干试剂连同荧光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质扩增阶段同时记录来自发光标记物的发光信号的检测。在本专利技术的优选的实施方案中，生物样品取自采样系统，并且通过将采样系统加载至反应盒(6)中来进行阶段a)。在本专利技术的另一个优选的实施方案中，加热分离室和/或反应室通过具有温度检测器的LED上的多个加热单元进行，优选发射波长范围在350nm至530nm内的电磁辐射。在本专利技术的另一个优选的实施方案中，具有温度检测器的LED的加热单元包括光学温度检测器，其检测波长范围为4μm至12μm的电磁辐射。在本专利技术的另一个优选的实施方案中，使用采样系统中的毛细管的毛细力获取生物样品。优选地，用于遗传物质扩增的冻干的试剂包括脱氧核苷酸、特异性引物序列、反应缓冲液、镁离子Mg2+(优选呈MgSO4的形式)、能够进行扩增反应的聚合酶(优选Bst3.0聚合酶)。同样优选地，嵌入所检测的遗传物质的冻干的荧光标签是SYBRGreen。对于检测，根据本专利技术的第一方面和第二方面，实时检测在5'端附接有量子点分子和在3'端附接有猝灭剂的核酸扩增产物以及终点技术寡核苷酸。所使用的寡核苷酸的序列与位于所设计的引物F1和B1c之间的脱氧核糖核酸片段的扩增区域部分互补，并且对于位于所设计的引物F1c和B1之间的核酸片段的扩增区域部分是互补的。在扩增反应期间，使用具有链置换活性和5'>3'外切核酸酶活性的聚合酶，如全长BstDNA聚合酶。在脱氧核糖核酸扩增反应期间，探针与经扩增的DNA片段中的互补片段结合，在扩增子延伸期间，由于聚合酶的外切核酸酶性质，附接的寡核苷酸被降解，导致猝灭剂与量子点分离。作为量子点与猝灭剂分离的结果，在用对生成量子点的材料有特异性的辐射波长来激发量子点之后，电磁辐射在UV、IR或VIS范围内发射。发射的信号由光敏元件记录。量子点的使用导致检测阈值的显著降低，这是由于使用具有更高功率的激发光源的可能性，由此可能记录来自小得多的量的释放的量子点的电磁辐射的发射。此外，使用量子点来标记寡核苷酸片段允许激发波长与其中发生电磁辐射检测的发射信号的波长更好地分离。更重要的是，与传统的荧光染料相比，量子点具有提高的漂白耐久性，这有利于在整个扩增反应期间进行检测。更优选地，反应盒包括三个反应室，包括包含针对测试的遗传物质的特异性引物的测试室、含有对生物材料样品来源的遗传物质的特定部分有特异性的引物的阳性对照室、和含有反应组分且无引物的阴性对照室。在本专利技术的优选实施方案中，在俯视图中的反应室是圆形的，互补的并在中间用阀或隔膜相互连接。在本专利技术的另一个优选的实施方案中，在阶段c)，将分离室加热至95℃持续5分钟至10分钟。在本专利技术的又一个优选的实施方案中，在阶段e)，将分离室加热至65℃持续15分钟至60分钟。优选地，阶段b)通过第一泵完成，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的水箱形式或活塞和波纹管的第一泵完成。同样优选地，步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测生物样品中遗传物质的方法，其包括以下阶段：a)在将反应盒(6)置于测量设备中之后或之前，将所述生物样品加载至反应盒(6)中，b)将收集的生物样品带至分离室(7)中，c)通过加热所述分离室(7)，从测试样品中分离生物材料，d)将分离的遗传物质移入多个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，e)通过加热所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)来扩增遗传物质，其特征在于在至少一个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)内部存在用于扩增遗传物质的冻干试剂连同荧光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质的扩增阶段同时记录来自荧光标记的荧光信号的检测。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.21 PL P.4199071.检测生物样品中遗传物质的方法，其包括以下阶段：a)在将反应盒(6)置于测量设备中之后或之前，将所述生物样品加载至反应盒(6)中，b)将收集的生物样品带至分离室(7)中，c)通过加热所述分离室(7)，从测试样品中分离生物材料，d)将分离的遗传物质移入多个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，e)通过加热所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)来扩增遗传物质，其特征在于在至少一个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)内部存在用于扩增遗传物质的冻干试剂连同荧光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质的扩增阶段同时记录来自荧光标记的荧光信号的检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于生物样品取自采样系统(1)，并且通过将所述采样系统(1)加载至所述反应盒(6)中来进行阶段a)，其中通过具有温度检测器(23)的LED上的多个加热单元，优选发射波长范围为350nm至530nm的电磁辐射，进行分离室(7)和/或反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)的加热，并且具有温度检测器(23)的LED的加热单元包括检测波长范围为4μm至12μm的电磁辐射的光学温度检测器(25)。3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于采用所述采样系统(1)中的毛细管(2)的毛细力来采集生物样品，以及用于遗传物质扩增的冻干试剂包括脱氧核苷酸、特异性引物序列、反应缓冲液、镁离子Mg2+，优选呈MgSO4形式、能够进行扩增反应的聚合酶，优选Bst3.0聚合酶，其中嵌入所检测的遗传物质的冻干的荧光标签是SYBRGreen。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述反应盒(6)包括三个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)，其包括测试室(8.1)、阳性对照室(8.2)以及阴性对照室(8.3)，所述测试室包含针对所测试的遗传物质的特异性引物，所述阳性对照室含有对生物材料样品所来源的遗传物质的特定部分有特异性的引物，所述阴性对照室含有反应组分但没有引物。5.如权利要求8所述的方法，其特征在于在俯视图中的所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)是圆形的，互补的并在中间用阀或隔膜(33)相互连接。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在阶段c)将所述分离室加热至95℃持续5分钟至10分钟，其中在阶段e)将所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)加热至65℃持续15分钟至60分钟，以及阶段b)通过第一泵(P1)完成，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的水箱形式或活塞和波纹管的第一泵完成，以及步骤d)通过第二泵(P2)完成，优选以连接至压力产生室的隔膜封闭的中空室形式的第二泵完成，并且包括将反应盒(6)加热至高于100℃的温度的阶段，优选通过具有温度检测器(23)的LED上的多个加热单元加热。7.用于检测生物样品中遗传物质的设备，其包括反应盒(6)和测量设备，所述测量设备包括具有容纳所述反应盒(6)的插座的测量室(10)，其中所述反应盒(6)包括用于分离遗传物质的分离室(7)，所述分离室通过通道与用于扩增分离的遗传物质的所述反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)连接，其特征在于在至少一个反应室(8.1、8.2、8.3、8.4)内部存在用于扩增遗传物质的冻干试剂连同发光染料，其包括能结合待检测的遗传物质的荧光染料或量子点，而与遗传物质的扩增阶段同时记录了来自发光标记物的发光信号的检测。8.如权利要求7所述的设备，其特征在于，所述设备包括可拆卸的采样系统(1)、用于成像控制和分析的测量模块(16)、通信模块(17)、电源模块(18)和显示器模块(19)...

【专利技术属性】
技术研发人员：米伦·托卡斯基，亨里克·沃尔德马尔·罗古斯扎克，塔德乌什·玛丽安·多布斯，莱塞克·戈龙加，阿卡迪乌斯·彼得·达布罗夫斯基，玛尔歌泽塔·马洛多布拉马苏尔，达米安·罗穆阿尔德·安德烈耶夫斯基，
申请(专利权)人：吉诺慕特克有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL