脂蛋白a测定试剂盒及其制备方法,涉及体外诊断试剂领域。本发明专利技术中的试剂1包括浓度为20~100mmol/L的甘氨酸、浓度为5~100g/L的PEG 6000、浓度为0.1~1mL/L的procline 300;试剂2包括浓度为20~100mmol/L活化缓冲液,浓度为20~100mmol/L的稀释缓冲液,浓度为20~100mmol/L的保存缓冲液、直径为50~180nm胶乳微球、浓度为0.1~1mg/mL脂蛋白a单克隆抗体、浓度为0.1%~2.5%封闭剂。本发明专利技术采用胶乳免疫比浊法进行测定,结果稳定可靠,准确度、线性范围和分析灵敏度高,特异性好。
Lipoprotein a determination kit and its preparation method
【技术实现步骤摘要】
脂蛋白a测定试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及体外诊断试剂
,具体涉及一种脂蛋白a测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
脂蛋白a含量的测定在临床上的检测方法主要有:透射免疫比浊法、ELISA法等。现有的胶乳免疫比浊法试剂盒,一般包括试剂1和试剂2,试剂1为适当的缓冲液,试剂2为胶乳包被的抗体溶液,涉及的关键技术主要是缓冲液的选择和包被抗体过程中设计活化物质选择的问题。例如:公开号为CN105675891A的中国专利公开了一种脂蛋白a(Lp(a))测定试剂盒,该试剂盒包括试剂R1、试剂R2,试剂R1为适当的缓冲液;试剂R2是用Lp(a)抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒置于缓冲液中,采用EDC活化物质。目前市场上大多数同类试剂盒的线性范围窄,分析灵敏度都不高。
技术实现思路
为了解决现有脂蛋白a测定试剂盒存在的线性范围窄、分析灵敏度低的问题,本专利技术提供一种脂蛋白a测定试剂盒及其制备方法,该试剂盒利用胶乳免疫比浊法原理用于体外定量测定人血清中脂蛋白a的含量。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下:本专利技术的脂蛋白a测定试剂盒,包括:试剂1和试剂2;所述试剂1包括:浓度为50~100mmol/L的甘氨酸、浓度为5~100g/L的PEG6000、浓度为0.1~1mL/L的procline300;所述试剂2包括:浓度为20~100mmol/L的活化缓冲液,浓度为20~100mmol/L的稀释缓冲液,浓度为20~100mmol/L的保存缓冲液、直径为50~180nm的胶乳微球、浓度为0.1~1mg/mL的脂蛋白a单克隆抗体、浓度为0.1~2.5%的封闭剂。作为优选的实施方式,所述试剂1包括:浓度为100mmol/L的甘氨酸、浓度为50g/L的PEG6000、浓度为0.1mL/L的procline300。作为优选的实施方式,所述试剂2包括:浓度为50mmol/L的活化缓冲液,浓度为100mmol/L的稀释缓冲液,浓度为50mmol/L的保存缓冲液、直径为100nm的胶乳微球、浓度为1mg/mL的脂蛋白a单克隆抗体、浓度为1%的封闭剂。作为更优选的实施方式,所述活化缓冲液为MES缓冲液;所述稀释缓冲液为PBS缓冲液;所述保存缓冲液为甘氨酸缓冲液;所述封闭剂为BSA。作为优选的实施方式,所述试剂2的制备方法如下:(1)用活化缓冲液洗涤胶乳微球两次,10000r/min离心30min,得到胶乳微球沉淀;(2)将步骤(1)制备的胶乳微球沉淀用活化缓冲液悬起,混匀,得到胶乳悬液;(3)将步骤(2)制备的胶乳悬液进行偶联反应,依次加入浓度为20mg/mL的EDC溶液和浓度为40mg/mL的NHS溶液,每次加入后室温震荡混匀15min,用9000r/min离心30min,去上清,得到胶乳颗粒沉淀;(4)将步骤(3)制备的胶乳颗粒沉淀用缓冲稀释液悬起,混匀;(5)脂蛋白a单克隆抗体用缓冲稀释液稀释,包被抗体,将抗体溶液加入步骤(4)中,边加入边震荡混匀,胶乳颗粒浓度为0.5%(w/v),脂蛋白a单克隆抗体浓度为1mg/mL,室温孵育2h;(6)向步骤(5)的反应液中加入1%BSA封闭,室温震荡孵育过夜;(7)将步骤(6)制备的溶液用9000r/min离心30min,去上清,加入保存缓冲液处理沉淀,4℃保存。本专利技术的脂蛋白a测定试剂盒的制备方法,包括以下步骤:步骤一、配制试剂1向容器中加入总配制量20~50%的纯化水,再按照配比浓度加入甘氨酸,搅拌均匀使其完全溶解,再依次加入PEG6000、procline300,搅拌均匀使其完全溶解,向容器中补加纯化水至总配制量,过滤,灌装于试剂瓶中,获得试剂1;步骤二、配制试剂2将胶乳微球经活化缓冲液活化、包被抗体、封闭后获得试剂2。作为优选的实施方式,步骤一的具体过程如下:用量筒量取纯化水500mL倒入1L烧杯中,加入甘氨酸7.507g,搅拌均匀使其完全溶解,再加入PEG600050g、procline300100μL,搅拌均匀使其完全溶解;补加纯化水至1L,过滤,灌装于试剂瓶中,即为试剂1。作为优选的实施方式,步骤二的具体过程如下:(1)用活化缓冲液洗涤胶乳微球两次,10000r/min离心30min,得到胶乳微球沉淀;(2)将步骤(1)制备的胶乳微球沉淀用活化缓冲液悬起,混匀,得到胶乳悬液;(3)将步骤(2)制备的胶乳悬液进行偶联反应,依次加入浓度为20mg/mL的EDC溶液和浓度为40mg/mL的NHS溶液,每次加入后室温震荡混匀15min,用9000r/min离心30min,去上清,得到胶乳颗粒沉淀;(4)将步骤(3)制备的胶乳颗粒沉淀用缓冲稀释液悬起,混匀;(5)脂蛋白a单克隆抗体用缓冲稀释液稀释,包被抗体,将抗体溶液加入步骤(4)中,边加入边震荡混匀,胶乳颗粒浓度为0.5%(w/v),脂蛋白a单克隆抗体浓度为1mg/mL,室温孵育2h;(6)向步骤(5)的反应液中加入1%BSA封闭,室温震荡孵育过夜;(7)将步骤(6)制备的溶液用9000r/min离心30min,去上清,加入保存缓冲液处理沉淀,4℃保存。作为优选的实施方式,所述活化缓冲液包括MES缓冲液和NaCl溶液,所述MES缓冲液的浓度为20~100mmol/L,所述NaCl溶液的浓度20~100mmol/L,所述活化缓冲液的PH为5.0~6.0。作为更优选的实施方式,所述MES缓冲液的浓度为50mmol/L,所述NaCl溶液的浓度50mmol/L,所述活化缓冲液的PH为6.0。作为优选的实施方式,所述稀释缓冲液包括PBS缓冲液(Na2HPO4和NaH2PO4)和NaCl溶液,所述PBS缓冲液的浓度为20~100mmol/L,所述NaCl溶液的浓度为120~180mmol/L,所述稀释缓冲液的PH为7.0~8.0。作为更优选的实施方式,所述PBS缓冲液的浓度为100mmol/L,所述NaCl溶液的浓度为150mmol/L,所述稀释缓冲液的PH为7.2。作为优选的实施方式,所述保存缓冲液包括甘氨酸溶液和procline300,所述甘氨酸溶液的浓度为20~100mmol/L,所述procline300的浓度为0.05~0.15mL/L。作为更优选的实施方式,所述甘氨酸溶液的浓度为50mmol/L,所述procline300的浓度为0.1mL/L。本专利技术的有益效果是:本专利技术克服了抗体无法吸附到微球表面以及胶乳试剂稳定性差的难点,同时提高其测量的线性范围和分析灵敏度。本专利技术关键技术点在于试剂2的制备,在于活化剂的选择以及缓冲液种类、浓度以及PH的选择。本专利技术的脂蛋白a测定试剂盒采用胶乳免疫比浊法进行测定,该试剂盒结果稳定、可靠,准确度高、特异性好;一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。附图说明图1为实施例3中的线性相关图。图2为实施例4中的灵敏性试验图。具体实施方式本专利技术的脂蛋白a测定试剂盒,主要包括:试剂1和试剂2;其中,试剂1包括:浓度为50~100mmol/L的甘氨酸、浓度为5~100g/L的PEG6000、浓度为0.1~1mL/L的procline300;其中,试剂2包括:浓度为20~100mmol/L的活化缓冲液,浓度为20~100mmol/L的稀释缓冲液,浓度为20~100mmol/L的保存缓冲液、直径为5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.脂蛋白a测定试剂盒,其特征在于,包括:试剂1和试剂2;所述试剂1包括:浓度为50~100mmol/L的甘氨酸、浓度为5~100g/L的PEG 6000、浓度为0.1~1mL/L的procline 300;所述试剂2包括:浓度为20~100mmol/L的活化缓冲液,浓度为20~100mmol/L的稀释缓冲液,浓度为20~100mmol/L的保存缓冲液、直径为50~180nm的胶乳微球、浓度为0.1~1mg/mL的脂蛋白a单克隆抗体、浓度为0.1~2.5%的封闭剂。
【技术特征摘要】
1.脂蛋白a测定试剂盒,其特征在于,包括:试剂1和试剂2;所述试剂1包括:浓度为50~100mmol/L的甘氨酸、浓度为5~100g/L的PEG6000、浓度为0.1~1mL/L的procline300;所述试剂2包括:浓度为20~100mmol/L的活化缓冲液,浓度为20~100mmol/L的稀释缓冲液,浓度为20~100mmol/L的保存缓冲液、直径为50~180nm的胶乳微球、浓度为0.1~1mg/mL的脂蛋白a单克隆抗体、浓度为0.1~2.5%的封闭剂。2.根据权利要求1所述的脂蛋白a测定试剂盒,其特征在于,所述试剂1包括:浓度为100mmol/L的甘氨酸、浓度为50g/L的PEG6000、浓度为0.1mL/L的procline300。3.根据权利要求1所述的脂蛋白a测定试剂盒,其特征在于,所述试剂2包括:浓度为50mmol/L的活化缓冲液,浓度为100mmol/L的稀释缓冲液,浓度为50mmol/L的保存缓冲液、直径为100nm的胶乳微球、浓度为1mg/mL的脂蛋白a单克隆抗体、浓度为1%的封闭剂。所述活化缓冲液为MES缓冲液;所述稀释缓冲液为PBS缓冲液;所述保存缓冲液为甘氨酸缓冲液;所述封闭剂为BSA。4.根据权利要求1所述的脂蛋白a测定试剂盒,其特征在于,所述试剂2的制备方法如下:(1)用活化缓冲液洗涤胶乳微球两次,10000r/min离心30min,得到胶乳微球沉淀;(2)将步骤(1)制备的胶乳微球沉淀用活化缓冲液悬起,混匀,得到胶乳悬液;(3)将步骤(2)制备的胶乳悬液进行偶联反应,依次加入浓度为20mg/mL的EDC溶液和浓度为40mg/mL的NHS溶液,每次加入后室温震荡混匀15min,用9000r/min离心30min,去上清,得到胶乳颗粒沉淀;(4)将步骤(3)制备的胶乳颗粒沉淀用缓冲稀释液悬起,混匀;(5)脂蛋白a单克隆抗体用缓冲稀释液稀释,包被抗体,将抗体溶液加入步骤(4)中,边加入边震荡混匀,胶乳颗粒浓度为0.5%(w/v),脂蛋白a单克隆抗体浓度为1mg/mL,室温孵育2h;(6)向步骤(5)的反应液中加入1%BSA封闭,室温震荡孵育过夜;(7)将步骤(6)制备的溶液用9000r/min离心30min,去上清,加入保存缓冲液处理沉淀,4℃保存。5.制备权利权利要求1至4中任意一项所述的脂蛋白a测定试剂盒的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、配制试剂1向容器中加入总配制量20~50%的纯化水,再按照配比浓度加入甘氨酸,搅...
【专利技术属性】
技术研发人员:侯丹,
申请(专利权)人:吉林瑞特生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:吉林,22
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