人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法技术

本发明专利技术公开了一种人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法，对分离后得到的人源脐带血造血干细胞进行预处理，并降温至4℃，得到样品；将样品转移至程序降温箱内并进行如下操作：1)4℃等待3‑4min；2)以1℃/min的速度降温，至样品的温度为‑5℃；3)以21℃/min的速度降温，至程序降温箱的温度为‑54℃；4)以17℃/min的速度降温，至程序降温箱的温度为‑17℃；5)以2℃/min的速度降温，至样品的温度为‑40℃；6)以10℃/min的速度降温，至样品的温度为‑80℃，转入液氮。本发明专利技术优点在于，通过合理设置降温速率及降温控制点，一方面缩短冻存过程，降低程序降温冷冻成本；另一方面，使细胞可以平稳度过相变点，避免冻存过程中细胞被破坏，提高复苏后细胞的细胞活率。

【技术实现步骤摘要】
人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法
：本专利技术涉及一种细胞程序降温冷冻方法，特别涉及一种人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法。
技术介绍
：人源脐带血是新生儿出生时脐带内和胎盘近胎儿一侧血管内的血液，其中含有的人源脐带血干细胞，常被用于移植治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤、骨髓造血功能衰竭、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患、某些实体肿瘤、呼吸道疾病、心血管疾病、内分泌疾病、消化类疾病等。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源。人源脐带血造血干细胞的数量是决定移植效率的直接影响因素，由于人源脐带血造血干细胞无法像其他干细胞(例如间充质干细胞)一样在体外大量扩增，因此人源脐带血造血干细胞显得尤为珍贵。脐带血造血干细胞一般是经过采集处理后，送至脐带血库进行冷冻保存并等待再次被利用，其冷冻复苏后的数量可直接影响到后期临床移植效率，因此其冻存复苏过程比其他类型干细胞要求更高。生物样品成功冻存是指细胞经冷冻复苏后，细胞仍然保持存活，且具有一定的生物活性。生物样品成功冻存取决于冷冻的速率、精确的温度控制和合理的温度梯度(+50℃～-80℃)。当温度降至-80℃时，大部分生物样品可转移至液氮中长期保存。在细胞冻存过程中，液相转变为固相，细胞代谢停止，丧失水分，导致细胞内盐、代谢物浓度改变，进而造成渗透压失衡，细胞破裂至死亡，将直接影响到冻存细胞活率。同时，冷冻速率太快或太慢，容易导致细胞内水分丧失或形成大冰晶，都不利于细胞存活。目前，用于人源脐带血造血干细胞冷冻保存的方法大致分为非程控降温冷冻法和程控降温冷冻法。非程控降温冷冻法是将造血干细胞不通过程控降温直接冷冻保存于-196℃下的液氮中，这种冷冻保存方法最大的缺点是，在温度急剧下降的过程中细胞内产生大量的冰晶，冰晶撑破细胞膜而导致细胞死亡；同时，随着保存时间的延长，造血干细胞回收率严重降低，保存时间不超过两年，并且保存效果易受到低温冰箱工作状态的影响，无法保证冻存的人源脐带血造血干细胞可以成功复苏。程控降温冷冻法通过使用程控降温仪，选择合适的冻存液，制备合适的探针，设定合适的升降温速率，可有效保证数量有限的人源脐带血造血干细胞的活率；但是，总耗时较长，大约为1小时10分钟左右，冷冻过程耗时长就造成液氮消耗量大，成本高；同时，该法细胞回收率、细胞活率不高，不能满足人源脐带血造血干细胞的使用需求。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种降温程序设计合理、冻存过程耗时大大缩短，同时降低了干细胞程序降温冷冻成本、复苏后脐带血造血干细胞的回收率和细胞活率大大提高的人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法。本专利技术由如下技术方案实施：人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法，对分离后得到的所述人源脐带血造血干细胞进行预处理，并降温至4℃，得到样品；将所述样品转移至程序降温箱内并进行如下操作：1)4℃等待3-4min；2)以1℃/min的速度降温，至所述样品的温度为-5℃；3)以21℃/min的速度降温，至所述程序降温箱的温度为-54℃；4)以17℃/min的速度降温，至所述程序降温箱的温度为-17℃；5)以2℃/min的速度降温，至所述样品的温度为-40℃；6)以10℃/min的速度降温，至所述样品的温度为-80℃，转入液氮中，使所述液氮完全淹没所述样品。进一步的，所述预处理具体为，向所述人源脐带血造血干细胞加入冷冻保护剂，所述人源脐带血造血干细胞与所述冷冻保护剂的添加体积比为4-5：1，使所述人源脐带血造血干细胞与所述冷冻保护剂充分混合并置于冰水中静置10min至4℃，得到所述样品。上述过程中，冷冻保护剂为origen生产的Cryo-SureDEX40，为市售试剂耗材。本专利技术的优点：通过合理设置降温速率及降温控制点，一方面，关注人源脐带血造血干细胞相变点与降温控制点的关系，使降温控制点趋近于人源脐带血造血干细胞相变点，在此基础之上，通过快速降温与细胞内水分结晶放热发生温度补偿效应，然后使箱体快速升温，并使人源脐带血造血干细胞冻存过程可以平稳度过相变点，避免冻存过程中人源脐带血造血干细胞被破坏，提高复苏后人源脐带血造血干细胞的细胞活率，进而可以延长人源脐带血造血干细胞保存时间；另一方面，缩短冻存过程，冻存过程耗时控制在55min以内，减少了程控降温过程中液氮的使用量，降低了干细胞程序降温冷冻成本。附图说明：为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例3冻存前的CD34+细胞率流式细胞图。图2为实施例3复苏后的CD34+细胞率流式细胞图。图3为实施例3的程序降温曲线图。图4为实施例3冷冻相变点温度曲线局部放大图。图5为实施例4冷冻冻存前的CD34+细胞率流式细胞图。图6为实施例4冷冻复苏后的CD34+细胞率流式细胞图。图7为实施例5冷冻冻存前的CD34+细胞率流式细胞图。图8为实施例5冷冻复苏后的CD34+细胞率流式细胞图。图9为实施例5冷冻的程序降温曲线图。图10为实施例5冷冻相变点温度曲线局部放大图。具体实施方式：下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：实施例1为本专利技术的人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法，对分离后得到的人源脐带血造血干细胞进行预处理，预处理具体为，向人源脐带血造血干细胞加入冷冻保护剂，冷冻保护剂为origen生产的Cryo-SureDEX40，人源脐带血造血干细胞与冷冻保护剂的添加体积比为4：1，使人源脐带血造血干细胞与冷冻保护剂充分混合并置于冰水中静置10min，降温至4℃，得到样品。将样品转移至程序降温箱内并进行如下操作：1)4℃等待3min；其目的是使程序降温箱及探针温度同时接近4℃，为下一步降温做准备；2)以1℃/min的速度降温，至样品的温度为-5℃；其目的是逐步将温度降至人源脐带血造血干细胞的相变点，使此处降温控制点更接近于人源脐带血造血干细胞的相变点，能更精准的控制细胞结晶放热的过程，使细胞降温曲线更加平稳，在后续快速降温过程中，样品温度下降不超过5度，减少温度变化程度能更好的保护细胞，提高细胞的冷冻成活率；3)以21℃/min的速度降温，至程序降温箱的温度为-54℃；其目的是为下一步温度补偿做准备；在此过程中，样品温度从上一步的-5℃下降至-10℃，样品温度下降不超过5℃，对细胞活性影响小；4)以17℃/min的速度降温，至程序降温箱的温度为-17℃；由于程序降温箱内部的人源脐带血造血干细胞不断释放热量，降低降温速率后，程序降温箱箱体温度由-54℃升至-17℃，程控降温仪会通过风扇大量排风，降低箱体内的氮气升温，这样人源脐带血造血干细胞放热结束后，样品的温度不会快速下降，其温度始终缓慢的下降，这样可以避免相变点给人源脐带血造血干细胞带来的破坏，通过迅速调高温度，利用温度补偿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法，其特征在于，对分离后得到的所述人源脐带血造血干细胞进行预处理，并降温至4℃，得到样品；将所述样品转移至程序降温箱内并进行如下操作：1)4℃等待3‑4min；2)以1℃/min的速度降温，至所述样品的温度为‑5℃；3)以21℃/min的速度降温，至所述程序降温箱的温度为‑54℃；4)以17℃/min的速度降温，至所述程序降温箱的温度为‑17℃；5)以2℃/min的速度降温，至所述样品的温度为‑40℃；6)以10℃/min的速度降温，至所述样品的温度为‑80℃，转入液氮中，使所述液氮完全淹没所述样品。

【技术特征摘要】
1.人源脐带血造血干细胞程序降温冷冻方法，其特征在于，对分离后得到的所述人源脐带血造血干细胞进行预处理，并降温至4℃，得到样品；将所述样品转移至程序降温箱内并进行如下操作：1)4℃等待3-4min；2)以1℃/min的速度降温，至所述样品的温度为-5℃；3)以21℃/min的速度降温，至所述程序降温箱的温度为-54℃；4)以17℃/min的速度降温，至所述程序降温箱的温度为-17℃；5)以2℃/min的速度降温，至所...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋丽霞，胡斯乐，闫海军，
申请(专利权)人：内蒙古银宏干细胞生命科技投资有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15