抗菌肽O3TR和C12O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了抗菌肽O3TR和C12O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用。研究结果显示，抗菌肽O3TR和C12O3TR能够有效防治柑橘果实采后绿霉病，其杀菌能力强，瞬时杀菌能力优于已有文献报道能有效控制柑橘果实采后绿霉病的抗菌肽PAF56和BP21，长效杀菌能力优于抗菌肽PAF56，且抑菌稳定性好，不受温度、pH、Na

Application of Antimicrobial Peptides O3TR and C12O3TR in Preparing and Controlling Postharvest Chloromycosis of Citrus Fruits

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽O3TR和C12O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用
本专利技术涉及抗菌肽O3TR和C12O3TR在果蔬保鲜领域的应用。
技术介绍
柑橘果实在采后贮藏运输过程中易受指状青霉（Penicilliumdigitatum）侵染而引起绿霉病病害，导致大量的经济损失。在现有的柑橘采后病害防治方法中，化学杀菌剂的使用最为普遍，但其毒性大，对人体健康和环境存在潜在威胁，且易使病原微生物对其产生抗性，因而使用逐渐受到限制。抗菌肽（antimicrobialpeptides,AMPs）是一类有抗菌活性的小分子多肽的总称，广泛存在于各种生物体内，因作用机制不同于化学杀菌剂和抗生素，病原微生物不易对其产生抗性，对环境无污染，使其成为替代化学杀菌剂和抗生素的理想资源。近年来，抗菌肽在医药、农业、食品及畜牧等行业受到越来越多的关注，但在果蔬采后病害控制方面的研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于筛选能够有效防治柑橘果实采后绿霉病且杀菌能力强、稳定性好的抗菌肽，以拓宽抗菌肽在果蔬保鲜领域的应用范围，同时为柑橘果实采后绿霉病的防治提供新的解决方法。经研究，本专利技术提供如下技术方案：1、抗菌肽O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用；所述抗菌肽O3TR的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其C端酰胺化修饰。2、抗菌肽C12O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用；所述抗菌肽C12O3TR的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其N端十二烷酰化修饰，C端酰胺化修饰。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了抗菌肽O3TR和C12O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用。研究结果显示，抗菌肽O3TR和C12O3TR能够有效防治柑橘果实采后绿霉病，其杀菌能力强，瞬时杀菌能力优于已有文献报道能有效控制柑橘果实采后绿霉病的抗菌肽PAF56和BP21，长效杀菌能力优于抗菌肽PAF56，且抑菌稳定性好，不受温度、pH、Na+、K+等的影响。本专利技术拓宽了抗菌肽O3TR和C12O3TR在果蔬保鲜领域的应用范围，也为柑橘果实采后绿霉病的防治提供了新的解决方法。附图说明图1为七种抗菌肽对柑橘果实采后绿霉病的控制效果，其中A为发病率，B为病斑直径。图2为接种P.digitatum6天后对照组与七种抗菌肽处理组的柑橘果实对比。图3为五种抗菌肽对柑橘果实采后绿霉病的控制效果对比，其中A和B为抗菌肽与病原菌混合后立即接种，A为发病率，B为病斑直径；C和D为抗菌肽与病原菌混合16h后接种，C为发病率，D为病斑直径。图4为接种P.digitatum6天后对照组与五种抗菌肽0h（抗菌肽与病原菌混合后立即接种）和16h（抗菌肽与病原菌混合16h后接种）处理组的柑橘果实对比。图5为温度对抗菌肽O3TR（A）、C12O3TR（B）和Jelleine-I（C）抑菌稳定性的影响。图6为pH对抗菌肽O3TR（A）、C12O3TR（B）和Jelleine-I（C）抑菌稳定性的影响。图7为金属离子对抗菌肽O3TR（A1，A2）、C12O3TR（B1，B2）和Jelleine-I（C1，C2）抑菌稳定性的影响。图1和图3中，标有相同小写英文字母（a、b、c）的组之间不存在显著差异（p＞0.05）；标有不同小写英文字母（a、b、c）的组之间存在显著差异（p<0.05）。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。本专利技术先从已知的大量抗菌肽中筛选出文献报道具有广谱和高效抑菌性的七种阳离子短链抗菌肽：O3TR（人工序列）、C12O3TR（人工序列）、dhvar5（来源于人类乳铁蛋白）、hLF(1-11)（来源于人类乳铁蛋白）、LDP-NLS（人工序列）、Jelleine-I（来源于意大利蜜蜂（Apismellifera））和Osmin（来源于红壁蜂（Osmiarufa）），然后使用固相合成方法合成这七种抗菌肽，通过果实试验明确这七种抗菌肽对柑橘果实采后绿霉病的控制效果，筛选出确实能够有效控制柑橘果实采后绿霉病的抗菌肽，并与文献报道的能有效控制柑橘果实采后绿霉病的抗菌肽PAF56和BP21进行瞬时杀菌能力和长效杀菌能力对比，筛选出杀菌能力更强的抗菌肽，对其进行抑菌稳定性测试，最终筛选出杀菌能力强、抑菌稳定性好的抗菌肽。一、实验材料1、抗菌肽委托南京金斯瑞公司使用固相合成方法合成纯度>90%的如下抗菌肽：O3TR：氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其C端酰胺化修饰（OOWW-NH2，O表示鸟氨酸）；C12O3TR：氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其N端十二烷酰化修饰，C端酰胺化修饰（(C12H23O)-OOWW-NH2）；dhvar5：氨基酸序列如SEQIDNo.2所示（LLLFLLKKRKKRKY）；hLF(1-11)：氨基酸序列如SEQIDNo.3所示（GRRRRSVQWCA）；LDP-NLS：氨基酸序列如SEQIDNo.4所示（KWRRKLKKLRPKKKRKV）；Jelleine-I：氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，其C端酰胺化修饰（PFKLSLHL-NH2）；Osmin：氨基酸序列如SEQIDNo.6所示（GFLSALKKYLPIVLKHV）；PAF56：氨基酸序列如SEQIDNo.7所示（GHRKKWFW）；BP21：氨基酸序列如SEQIDNo.8所示，其N端乙酰化修饰，C端酰胺化修饰（Ac-FKLFKKILKVL-NH2）。将合成的抗菌肽分别用无菌超纯水配成1mmol/L的母液，-40℃贮藏。2、病原菌指状青霉（P.digitatum）分离于发病柑橘果实，并通过分子生物学方法鉴定。用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）于25℃培养病原菌，7天后收集孢子并用无菌水调至所需浓度。二、实验方法1、抗菌肽对柑橘果实采后绿霉病的控制作用柑橘果实随机分组：无菌水对照组和抗菌肽处理组，每组15个果实；每组果实以2%次氯酸钠溶液浸泡2min后清洗以除去表面残留污物，果实表面赤道部位用75%酒精擦拭消毒后，用灭菌打孔器在果实赤道部位等距打两个孔（深3mm，直径4mm）；无菌水对照组接种10μL无菌水于每孔中；抗菌肽处理组将新鲜P.digitatum孢子悬浮液与抗菌肽溶液混合后立即接种或16h后接种10μL于每孔中，P.digitatum孢子和抗菌肽的终浓度分别为1×104CFU/mL和100μmol/L；待孔中液体被完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋（170mm×140mm）将果实单果包装，置于25℃、相对湿度为90-95%的环境中贮藏；每天统计发病率并测量病斑直径。实验重复3次。2、不同温度对抗菌肽抑菌活性的影响将不同浓度的抗菌肽溶液分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃静置5min后快速冷却至常温（25℃），以常温（25℃）静置未加热的抗菌肽溶液为对照；将180μL含有20倍稀释马铃薯葡萄糖液体培养基（5%PDB）的P.digitatum孢子悬浮液和20μL抗菌肽溶液混合后立即加入无菌96孔微量板中，P.digitatum孢子的终浓度为1×104CFU/mL，抗菌肽的终浓度分别为0、3.12、6.25、12.5、25、50、100μmol/L；然后将96孔板置25℃恒温培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗菌肽O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用；所述抗菌肽O3TR的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其C端酰胺化修饰。

【技术特征摘要】
1.抗菌肽O3TR在制备防治柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用；所述抗菌肽O3TR的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其C端酰胺化修饰。2.抗菌肽C12...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾凯芳，李心丹，邓丽莉，姚世响，阮长晴，易兰花，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50