本发明专利技术的课题在于，提供一种具有抗原结合活性且能够简便地制造的片段抗体，该片段抗体即使是通过大肠杆菌表达体系得到的，也与Fv‑clasp(v1)相比其自身及其与抗原分子的复合体的结晶化能力更高。本发明专利技术涉及由在抗体的重链结构域(VH区域)的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使VH区域的根据乔西亚(Chothia)法的抗体残基编号112的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽(VH(112C)‑SARAH)、与在抗体的轻链结构域(VL区域)的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使从SARAH结构域的C末端起第13位的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽(VL‑SARAH(37C))的复合体构成的片段抗体。
Fragment Antibody and Crystallization of Proteins Using Fragment Antibody
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】片段抗体及使用该片段抗体的蛋白质的结晶化方法
本专利技术涉及一种片段抗体及使用该片段抗体的蛋白质的结晶化方法。
技术介绍
以IgG为主的抗体分子因其与抗原分子结合的性质而成为目前研究、治疗、诊断领域中不可或缺的工具。抗体分子通常是分子量大的多结构域糖蛋白质，分子内有复数个二硫键(以下，有时简称为S-S键)，因此需要使用动物细胞来表达。但是，通常，使用动物细胞的蛋白质的生产与使用细菌的生产相比，除了耗费成本以外，重组抗体分子的表达大多较差，因此存在生产率低的问题。为了补偿上述抗体分子的生产中的问题点，设计了使用分子量小的片段抗体。片段抗体具有组织浸润性高等优点。作为典型的片段抗体，可举出由可变结构域(VH区域和VL区域)和恒定结构域(CH1区域和CL区域)构成的Fab。但是，Fab通常是对全长抗体进行纯化之后再对其进行酶处理接着经过进一步的纯化而得到的，因此存在生产成本高的问题。另外，作为其他片段抗体，已知通过长且柔性的连接肽将VH区域或VL区域的C末端与另一个N末端结合的单链Fv(以下，有时简称为scFv)(非专利文献1)。然而，由于存在长且柔性的连接肽，因此有时scFv彼此产生凝集。另外，也存在抗体的活性降低、不稳定等问题。因此，本专利技术人等为了解决以往的片段抗体存在的问题点，开发了通过形成反向平行的卷曲螺旋的人哺乳动物不育系20样激酶1(Mammaliansterile20-likekinase1，Mst1)的SARAH结构域的二聚体将VH区域和VL区域的C末端彼此结合的新的片段抗体(以下，有时简称为Fv-clasp第一代或Fv-clasp(v1))(非专利文献2)。该Fv-clasp(v1)是由作为在(a)抗体的重链结构域(VH区域)的C末端结合了人Mst1的SARAH结构域的N末端并且使该人Mst1的从SARAH结构域的N末端起第35位的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽、与作为在(b)抗体的轻链结构域(VL区域)的C末端结合了人Mst1的SARAH结构域的N末端并且使该人Mst1的从SARAH结构域的N末端起第24位的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽的复合体构成的片段抗体，并且是两个SARAH结构域通过突变的半胱氨酸间的二硫键结合的片段抗体。现有技术文献非专利文献非专利文献1：RobertE.Bird，1988，Science，JamesS.Huston，1988，PNAS。非专利文献2：有森贵夫，町田栞，藤井勇树，北乡悠，高木淳一，新片段抗体形式“Fv-clasp”的设计及其结构解析，第15次日本蛋白质科学会年会，平成27年6月25日。非专利文献3：ChothiaandLesk，Canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins，J.Mol.Biol.，196，901-917(1987)。非专利文献4：Al-Lazikani，B.，Lesk，A.M.&Chothia，C.(1997)，Standardconformationsforthecanonicalstructuresofimmunoglobulins.J.Mol.Biol.273，927-948。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术人等对针对各种目标抗原分子的Fv-clasp(v1)尝试了采用动物细胞或大肠杆菌的基因重组的表达、纯化、Fv-clasp(v1)的结晶化以及Fv-clasp(v1)与目标抗原分子的复合体的结晶化。其结果是，明确了特别地通过大肠杆菌表达体系得到的Fv-clasp(v1)存在不能得到Fv-clasp(v1)与目标抗原分子的复合体的结晶的情况或只能得到分辨率低的结晶的情况。因此，本专利技术的课题在于，提供一种具有抗原结合活性且能够简便地制造的片段抗体，该片段抗体即使是通过大肠杆菌表达体系得到的，也与Fv-clasp(v1)相比其自身及其与抗原分子的复合体的结晶化能力更高。用于解决课题的手段本专利技术人等为了解决上述课题，针对由在(a)抗体的重链结构域(VH区域)的C末端结合了人Mst1的SARAH结构域的N末端的肽(以下，有时简称为VH-SARAH)中的VH区域引入半胱氨酸的突变的肽、与在(b)抗体的轻链结构域(VL区域)的C末端结合了人Mst1的SARAH结构域的N末端的肽(以下，有时简称为VL-SARAH)中的SARAH结构域引入半胱氨酸的突变的肽的复合体构成的复数个片段抗体，专心研究了该片段抗体与抗原分子的复合体的结晶化。其结果是，如果使用由在(a)抗体的重链结构域(VH区域)的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使VH区域的根据乔西亚(Chothia)法的抗体残基编号112的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽(以下，有时简称为VH(112C)-SARAH)、与在(b)抗体的轻链结构域(VL区域)的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使从SARAH结构域的C末端起第13位的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽(以下，有时简称为VL-SARAH(37C))的复合体构成的片段抗体，并且该片段抗体中，(c)VH(112C)-SARAH与VL-SARAH(37C)通过上述两个半胱氨酸间的二硫键结合(以下，有时简称为Fv-clasp第二代或Fv-clasp(v2))，则即使是通过大肠杆菌表达体系得到的Fv-clasp(v2)，其自身、Fv-clasp(v2)与抗原分子的复合体也具有结晶化能力。另外，也发现了Fv-clasp(v2)从进行结晶化条件的最优化前的筛选阶段开始能够得到Fv-clasp(v2)与抗原分子的复合体的高分辨率的结晶。另外，还发现了由于Fv-clasp(v2)促进难结晶化蛋白质的结晶化，因此其作为蛋白质结晶化促进用片段抗体发挥作用。此外，发现了Fv-clasp(v2)与Fv-clasp(v1)、scFv相比热稳定性高，从而完成了本专利技术。本专利技术涉及以下的片段抗体、以及使用该片段抗体的蛋白质的结晶化方法。[1]一种片段抗体，其中，其是由在(a)抗体的重链结构域(VH区域)的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使VH区域的根据乔西亚(Chothia)法的抗体残基编号112的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽(VH(112C)-SARAH)、与在(b)抗体的轻链结构域(VL区域)的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使从SARAH结构域的C末端起第13位的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽(VL-SARAH(37C))的复合体构成的片段抗体，并且，(c)VH(112C)-SARAH与VL-SARAH(37C)通过上述两个半胱氨酸间的二硫键结合。[2]如[1]所述的片段抗体，其中，所述VH(112C)-SARAH中的SARAH结构域是从序列号1～8所示的序列中选出的序列(序列号1～8所示的序列)，所述VL-SARAH(37C)中的SARAH结构域是序列号9～16所示的序列。[3]如[1]所述的片段抗体，其中，所述VH(112C)-SARAH中的SARAH结构域是序列号1～2所示的序列，所述VL-SARAH(37C)中的SARAH结构域是序列号9～10所示的序列。[4]一种蛋白质结晶化促进用片段抗体，其中，其是由在(a)抗体的重链结构域(VH区域本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种片段抗体，其中，其是由VH(112C)‑SARAH与VL‑SARAH(37C)的复合体构成的片段抗体，所述VH(112C)‑SARAH是在抗体的重链结构域即VH区域的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使VH区域的根据乔西亚法的抗体残基编号112的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽，所述VL‑SARAH(37C)是在抗体的轻链结构域即VL区域的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使从SARAH结构域的C末端起第13位的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽，所述VH(112C)‑SARAH与所述VL‑SARAH(37C)通过上述两个半胱氨酸间的二硫键结合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.09 JP 2016-2186311.一种片段抗体，其中，其是由VH(112C)-SARAH与VL-SARAH(37C)的复合体构成的片段抗体，所述VH(112C)-SARAH是在抗体的重链结构域即VH区域的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使VH区域的根据乔西亚法的抗体残基编号112的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽，所述VL-SARAH(37C)是在抗体的轻链结构域即VL区域的C末端结合了SARAH结构域的N末端并且使从SARAH结构域的C末端起第13位的氨基酸残基突变为半胱氨酸的肽，所述VH(112C)-SARAH与所述VL-SARAH(37C)通过上述两个半胱氨酸间的二硫键结合。2.如权利要求1所述的片段抗体，其中，所述VH(112C)-SARAH中的SARAH结构域是序列号1～8所示的序列，所述VL-SARAH(37C)中的SARAH结构域是序列号9～16所示的序列。3.如权利要求1所述的片段抗体，其中，所述VH(112C)-SARAH中的SARAH结构域是序列号1～2所示的序列，所述VL-SARAH(37C)中的SARAH结构域是序列号9～10所示的序列。4.一种蛋白质结晶化促...
【专利技术属性】
技术研发人员：高木淳一，
申请(专利权)人：富士胶片和光纯药株式会社，国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP
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