二元杀虫CRY毒素制造技术

本主题发明专利技术涉及新类别的杀虫活性蛋白和编码这些蛋白质的多核苷酸序列。更具体地说，使用大约12‑24kDa和大约12‑14kDa的杀虫蛋白来控制玉米根虫。本主题发明专利技术包括用于控制西方玉米根虫和其他鞘翅目昆虫的方法和转基因植物。

Binary insecticidal CRY toxin

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】二元杀虫CRY毒素相关申请的交叉引用本申请要求2016年9月30日提交的美国临时申请62/402,316的优先权和权益。将该申请的全部内容通过提述并入本申请。序列标识列表并入将序列表的正式副本作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式提交，其文件名为“77990-US-NP_20170920_20170920Seq_ST25.txt”，建立于2017年08月30日，大小为83.8KB，并且与本说明书同时提交。包含在这个ASCII格式文件中的序列表是说明书的一部分，并将其通过提述完整并入本文。
本专利技术总体上涉及适用于农业科学的分子生物学领域。更具体地，某些实施方案涉及使用DNA区段作为蛋白质产生的诊断探针和模板的方法，以及蛋白质、融合蛋白载体和肽在昆虫控制和各种免疫学和诊断应用中的用途。还公开了在转基因植物细胞中的植物嵌入式保护剂的开发中制造和使用核酸区段的方法，所述转基因植物细胞含有本文中公开的DNA区段。背景人们每年花费数十亿美元来控制困扰农业的昆虫害虫。因这些昆虫害虫造成的损害每年另外损失数十亿美元。合成有机化学杀虫剂已成为用于控制昆虫害虫的主要工具，但生物杀虫剂，比如源自苏云金芽孢杆菌(B.t.)的杀虫蛋白，在某些领域发挥了重要作用。通过用B.t.遗传转化植物细胞能够产生抗虫植物。杀虫蛋白基因彻底改变了现代农业，提高了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。B.t.是一种革兰氏阳性细菌，其可产生被称为晶体蛋白的内毒素，通常称为Cry蛋白或Cry毒素，它们对某些目、属和种的昆虫具有选择性毒性。已表明许多不同的B.t.菌株产生杀虫Cry蛋白。包括产生杀虫Cry蛋白的B.t.菌株的组合物可商购获得并且用作环境可接受的杀虫剂。大多数杀虫性B.t.菌株对鳞翅目(Lepidoptera)昆虫(即毛虫)具有活性。其他B.t.菌株对双翅目昆虫(即苍蝇和蚊子)具有杀虫活性，或对鳞翅目昆虫和双翅目昆虫两者都具有杀虫活性。近几年，已经报道几个B.t.菌株产生对鞘翅目昆虫(即甲虫，比如玉米根虫)有毒的晶体蛋白。此类目前采用的毒性蛋白包括Cry3Bb1、修饰的Cry3A、eCry3.1Ab和二元毒素Cry34Ab1/Cry35Ab1(对于毒性活性需要两种不同的蛋白质)。无论是单独采用还是为了降低产生抗性的可能性的各种联合，这些蛋白质对于控制侵染玉米根的叶甲属物种有效。即使这些蛋白质已经成功地用作转基因作物植物中的昆虫控制剂，针对它们的作用的抗性也可能产生。以前这些Cry蛋白的分类根据是它们的目标昆虫类型。目前采用系统地对Cry基因进行分类的命名法，其根据是氨基酸序列同源性而不是昆虫特异性(Crickmore,N.等人，Microbiol.andMol.Bio.Rev.(1998)Vol.62:807-813；http://www.btnomenclature.info/)。已经描述了对鞘翅目昆虫和双翅目昆虫具有活性的30-kDa毒素蛋白的基因的克隆和表征(国际专利申请公开号WO95/02693，1995)。该基因分离自B.t.PS201T6，其编码现出与B.t.以色列亚种的CytA毒素具有64％序列同一性的29,906Da的蛋白质。很多B.t.蛋白已经用作植物嵌入式保护剂，从而产生迄今已成功注册、解除管制并被商业化的抗虫性转基因植物。在B.t.中发现了杀虫蛋白系统，其在WO97/40162中公开。这个系统包括两种蛋白质，一种大约14-15kDa，另一种约44-45kDa。还参见美国专利No.6,083,499和6,127,180。将这些蛋白质分别指定给Cry命名的Cry34和Cry35。已经公开了其他相关的二元蛋白质毒素系统。参见美国专利No.6,372,480；WO01/14417；和WO00/66742。还公开了编码此类蛋白质的植物优化基因，其中所述基因被工程化以使用在植物中优化表达的密码子。参见美国专利No.6,218,188。每年有超过1000万英亩的美国玉米被玉米根虫物种复合体侵染。玉米根虫物种复合体包括北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲，Diabroticabarberi)、南方玉米根虫(十一星根萤叶甲，D.undecimpunctatahowardi)和西方玉米根虫(玉米根萤叶甲，D.virgiferavirgifera)。其他物种包括墨西哥玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferazeae)(墨西哥玉米根虫)、黄瓜条叶甲(Diabroticabalteata)(巴西玉米根虫)。巴西玉米根虫复合体包括微绿根萤叶甲(Diabroticaviridula)和南美叶甲(Diabroticaspeciosa)。西方玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte))是整个美国玉米带的重要玉米害虫。由于针对化学杀虫剂和表达B.t.Cry毒素的转基因植物的抗性产生，WCR控制是一项重大挑战。WCR对Cry3Aa和Cry3Bb产生了显著的抗性，但对市场上出色的Cry34/35二元蛋白质对没有产生抗性。然而，由于WCRCry3抗性群体的出现，Cry34/35性状处于不断增加的选择压力之下。在许多增强抗性产生的情况下，更有可能产生针对所采用的毒素的抗性，无论是化学毒素还是蛋白质毒素。通常，抗性的产生直接取决于毒素在环境中部署的时间长度。在其中毒素剂量不足以确保食用一口含有毒素的组织的害虫的死亡率的情况下，抗性产生也更可能增加。因此，每咬一口都递送致死剂量的毒素是至关重要的；否则，更可能出现针对特定毒素的抗性产生。在共同地理区域内在易受共同地理区域内的相同或相似害虫影响的多个植物物种之上或之中重复使用同一种毒素更有可能引起针对该毒素的抗性的迅速产生，特别是在单个生长季节中存在多代特定的目标害虫的气候条件下更是如此。出于所有前述原因，对有限数量的毒性蛋白质或毒性化学物质的依赖性可导致针对这些害虫控制剂的抗性的产生。声称对玉米根虫表现出毒性作用的本领域中公开的其他蛋白质包括马铃薯贮藏蛋白、TICl00/101二元毒素、ET33/34二元毒素、TIC863、ET80/76二元毒素、ET70、Cry3Bb(美国专利No.6,501,009)、CrylC变体、Cry3A变体、Cry3、Cry3B、Cry34/35、5307、Axmil84、Axmi205、AxmiRl、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC3131、DIG-10、eHIP(美国专利申请公开号2010/0017914)和ω-Hexatoxin-Hvla(美国专利申请公开US2014-0366227Al)。在随后的商业实施方案中可以单独提供这些蛋白质或与其他毒性剂联合提供，以确保根虫产品的耐久性并降低抗性产生的可能性。尽管发现了许多来自B.t.的选择性蛋白质毒素，仍然迫切需要发现新的有效的害虫控制剂，所述害虫控制剂为农民提供经济效益，能够延迟或阻止抗性昆虫的产生，并且是环境可接受的。特别需要的是靶向控制广谱的经济上重要的昆虫害虫的药剂，其有效地控制对现有昆虫控制剂具有或可能变得具有抗性的昆虫群体，并且与目前部署的杀虫蛋白质毒素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种控制鞘翅目害虫的方法，其包括使所述鞘翅目害虫的肠暴露于增效蛋白与毒素蛋白的有效组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.30 US 62/402,3161.一种控制鞘翅目害虫的方法，其包括使所述鞘翅目害虫的肠暴露于增效蛋白与毒素蛋白的有效组合。2.权利要求1的方法，其中所述增效蛋白含有包含SEQIDNO:2的功能性氨基酸序列，并且其中所述毒素蛋白包括选自下组的毒素蛋白的任一者：SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103和105。3.权利要求1的方法，其中所述增效蛋白是SEQIDNO:2，并且其中所述毒素蛋白选自下组：SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103和105。4.权利要求1的方法，其中所述鞘翅目害虫是西方玉米根虫(WCR，DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)。5.权利要求2的方法，其中所述鞘翅目害虫是西方玉米根虫(WCR，DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)。6.权利要求3的方法，其中所述鞘翅目害虫是西方玉米根虫(WCR，DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte)。7.一种用于表达二元毒素的核酸构建体，其包含对于苏云金芽孢杆菌而言为外来的基因调控结构以及一个或多个编码二元毒素的DNA区段。8.权利要求7的核酸构建体，其中所述编码二元毒素的DNA区段包含一个或多个编码SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、71、74、76、82、86、88、91、93、95、97、99、101、103和105的DNA序列。9.权利要求7的核酸构建体，其中所述编码二元毒素的DNA区段包含一个或多个选自下组的DNA序列：SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、15、17、19、21、23、25、27、29、61、62、64、65、67、69、70、72、73、75、77和79。10.一种转基因植物或植物部分，其包含编码二元毒素的核酸序列，所述编码二元毒素的核酸序列包含权利要求7的核酸序列。11.一种转基因植物或植物部分，其包含编码二元毒素的核酸序列，所述编码二元毒素的核酸序列包含权利要求8的核酸序列。12.一种转基因植物或植物部分，其包含编码二元毒素的核酸序列，所述包含编码二元毒素的核酸包含权利要求9的核酸序列。13.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·E·纳瓦，H·李，S·Y·谭，T·徐，T·D·黑，V·奇奎娜，S·E·沃尔登，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国,US