一种筛选和/或评价物质的方法及其应用技术

一种筛选和/或评价化合物的方法及其应用，所述方法包括以下步骤：(1)对胚胎干细胞进行支持培养；(2)制备细胞球，并在含有待测化合物的分化培养基中进行分化培养得到包含内、中、外三个胚层细胞的腔状拟胚体；(3)通过分析胚胎发育的指标筛选和/或评价所述化合物。本发明专利技术可同时进行多种化合物单一或联合暴露的胚胎发育影响的评价，评价指标简单、直观，可对许多新型化合物、新型药物、污染物进行快速的初筛，为后续药理学、毒理学机理提供明确研究方向，且本发明专利技术所需供试品用量少，实验周期灵活。

A Method for Screening and/or Evaluating Substances and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种筛选和/或评价物质的方法及其应用
本专利技术属于细胞生物学与环境毒理学交叉领域，涉及一种筛选和/或评价物质的方法，可对不断增长的新化合物、新型污染物、新合成药物、天然提取药物等进行快速筛选与评价。
技术介绍
目前评价化合物效应的模型分为两类，分别为体内实验的动物模型和体外实验的细胞模型。对于动物模型，其优点是可以从整体水平评估ADME四相过程(即吸收、分布、代谢、排泄过程)，并能同时对不同脏器的药理学、毒理学作用进行排序分析；缺点是需要大量实验动物，个体差异及物种差别不能忽略，实验重复性较差，对供试的化合物需求量大，因此不适合进行大规模化合物的初步筛查。对于细胞模型，多采用癌细胞系和原代细胞作为实验模型。相比动物模型，这类细胞模型有更好的可重复性，能够在短期时间内进行大规模实验。但是由于实验细胞类型为癌细胞系或原代细胞，并不是生理状态下的健康细胞，同时无法进行胚胎以及器官发育过程的研究，所以很大的限制了研究的广度与深度。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术中利用胚胎干细胞相关技术作为支持进行研究，克服了以上困难。首先，胚胎干细胞是正常细胞，相比癌细胞系或原代细胞更接近健康生理环境；其次，胚胎干细胞具有无限增殖与多向分化这两个重要的特征。无限增殖即为在体外无限传代并保持正常状态，这就大大降低了批次不同所产生的误差。多向分化即具有分化为各个器官与组织的潜能，这就意味着在特定条件下，可以模拟不同器官或组织的发育过程，从胚胎干细胞分化为其他前体细胞或成熟细胞类型。由此可见，利用本专利技术进行化合物的胚胎发育阶段及不同器官早期发育过程的评价，不仅能够在短时间内高效评价大量的化合物，而且能够得到非常接近动物真实情况的实验数据，为后续的机理研究、化合物管控政策制定、新药临床前评估提供非常有力的基础与证据。本专利技术的目的是在特定培养条件下，胚胎干细胞(ESC)分化形成拟胚体(EmbryoidBody，EB)并在分化培养基中多向分化，模拟早期胚胎发育。在多向分化过程中，暴露不同化合物或其混合物，对早期胚胎发育的影响进行评价。为了达到上述目的，一方面，本专利技术提出一种筛选和/或评价物质的方法，包括以下步骤：(1)对胚胎干细胞进行支持培养；(2)制备细胞球，并在含有待测物质的分化培养基中进行分化培养得到包含内、中、外三个胚层细胞的腔状拟胚体；(3)通过分析胚胎发育的指标筛选和/或评价所述物质。在一些实施例中，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞或人胚胎干细胞。在一些实施例中，所述分化培养基包括：DMEM/F-12培养基、胰岛素、维生素C磷酸酯镁、转铁蛋白、硒酸钠、和DNA酶，优选地，各组分的含量为：胰岛素19.4μg/L、维生素C磷酸酯镁64mg/L、转铁蛋白10.7mg/L、硒酸钠14μg/L和DNA酶1mg/L。在一些实施例中，所述细胞球的制备方法包括将步骤(1)中得到的胚胎干细胞消化成单细胞悬液，然后在分化培养基中进行单细胞接种。在一些实施例中，单细胞接种的第一天，使用的分化培养基包括ROCK1抑制剂Y27632。在一些实施例中，所述分化培养基中Y27632的含量为10μM。在一些实施例中，单细胞的接种密度为1.8×106cells/mL至9.0×106cells/mL。在一些实施例中，所述物质包括环境污染物、药物、小分子抑制剂中的一种或多种，优选地，所述物质包括双酚类化合物、全氟化合物、PM2.5、黄酮类化合物中的一种或多种。在一些实施例中，所述指标包括基因表达水平、DNA甲基化水平、蛋白表达水平、代谢产物中的一种或多种。在一些实施例中，分析胚胎发育的指标的方法包括基因组学、蛋白组学、代谢组学、表观基因组学中的一种或多种。在一些实施例中，所述方法包括分析不同时间点不同胚层中发育相关的基因表达水平以评价物质的影响或效应。另一方面，本专利技术还提出所述方法在诱导胚胎干细胞定向分化中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1、本专利技术具备常规细胞模型评价化合物的一般特性，如仅需非常少量的供试化合物，节省时间，节约花费，在使用相对较少的人力情况下也可高通量评价不同化合物的效应；2、由于本专利技术是基于胚胎干细胞的细胞模型，所以可以很大程度贴近健康人体或动物生理状况；3、本专利技术通过胚胎干细胞形成拟胚体，可在体外模拟早期胚胎发育。这是其他模型不能替代的。在此过程中，暴露不同化合物，可通过基因表达和蛋白表达等生物学指标来评价化合物是否对胚胎早期发育过程产生影响；4、本专利技术极大程度模拟了早期胚胎发育过程，为化合物作用于细胞信号通路、转录调控、特异靶点等更深入的药理学/毒理学研究提供支持；5、基于本专利技术还可以进行特定器官或组织的定向诱导，研究化合物对某一特定细胞类群或器官的效应。附图说明图1为本专利技术实施例中的腔状拟胚体；图2为本专利技术实施例中暴露21天双酚类化合物的EB基因表达热图；图3A-3D为本专利技术实施例中四次独立重复实验基因表达热图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。在本专利技术的一个实施例中，利用本专利技术的方法评价环境污染物双酚类物质(BPS、BPF、BPE、BPA、BPB、BPZ、BPAF)对早期胚胎发育的发育毒性效应。1、人胚胎干细胞的支持培养：人胚胎干细胞H9在mTeSR1培养基中，生长于Vitronectin包被的培养皿中，当细胞生长覆盖皿底90％面积，克隆传代继续培养。本专利技术所使用的人胚胎干细胞系(H9)来源于NationalStemCellBankc/oWiCellResearchInstitute，系中科院上海生科院生化细胞所干细胞平台提供。2、制备细胞球，分化培养基中细胞球多向分化形成包含内、中、外三个胚层细胞的腔状拟胚体；①人胚胎干细胞H9用TrypLE消化液制成单细胞悬液，按至1.8×106cells/mL至9.0×106cells/mL的任一细胞密度接种于微孔培养板中制备大小均一的三维细胞球。特别的是，第一天单细胞接种时，使用的分化培养基中还需加入10μMROCK1抑制剂Y27632(用于抑制ROCK通路，使细胞存活下来)。分化培养基包括DMEM/F-12培养基、胰岛素(19.4μg/L)、维生素C磷酸酯镁(64mg/L)、转铁蛋白(10.7mg/L)、硒酸钠(14μg/L)、和DNA酶(1mg/L)。②第二天从微孔培养板中收集细胞球并加入含有不同环境污染物的分化培养基共孵育。③每天在显微镜下观察拟胚体，并每48小时换液一次。观察分化培养基中细胞团多向分化过程中是否出现腔体结构。3、早期胚胎发育毒性评价拟胚体能够形成腔体结构(如图1所示)，则视为分化成功。此时，可在不同时间点收集样品，进行基因表达水平的测定。本专利技术实施例收集了第21天的拟胚体，即七种不同双酚类化合物连续暴露21天。从热图(附图2)可知，与对照组(DMSO)相比，处理组基因表达水平受到影响，表示七种双酚类化合物对三胚层发育可能存在一定的干扰效应。图3A-3D为本专利技术实施例中四次独立重复实验基因表达热图。由图可知，本专利技术重复性良好，系统稳定。通过本专利技术的方法可以确定各种物质(例如环境污染物、创新化合物、天然药物、小分子抑制剂等，具体可以为双酚类、全氟化合物、PM2.5、黄酮类化合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选和/或评价物质的方法，包括以下步骤：(1)对胚胎干细胞进行支持培养；(2)制备细胞球，并在含有待测物质的分化培养基中进行分化培养得到包含内、中、外三个胚层细胞的腔状拟胚体；(3)通过分析胚胎发育的指标筛选和/或评价所述物质。

【技术特征摘要】
1.一种筛选和/或评价物质的方法，包括以下步骤：(1)对胚胎干细胞进行支持培养；(2)制备细胞球，并在含有待测物质的分化培养基中进行分化培养得到包含内、中、外三个胚层细胞的腔状拟胚体；(3)通过分析胚胎发育的指标筛选和/或评价所述物质。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞或人胚胎干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分化培养基包括：DMEM/F-12培养基、胰岛素、维生素C磷酸酯镁、转铁蛋白、硒酸钠、和DNA酶，优选地，各组分的含量为：胰岛素19.4μg/L、维生素C磷酸酯镁64mg/L、转铁蛋白10.7mg/L、硒酸钠14μg/L和DNA酶1mg/L。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞球的制备方法包括将步骤(1)中得到的胚胎干细胞消化成单细胞悬液，然后在分化培养基中进行单细胞接种，优选地，单细胞的接种密度为1.8×106cells/mL至9...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁小星，费凡，殷诺雅，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11