一种生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法。以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板PCR处理获得蓖麻毒素蛋白B链基因的PCR产物；利用家蚕核型多角体病毒BmNPV作为载体，构建了含有蓖麻毒素蛋白B链基因的重组病毒，利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主表达具有生物活性的重组蓖麻毒素蛋白B链。本发明专利技术以家蚕作为宿主生产重组蓖麻毒素蛋白B链，具有较强的生物活性，有利于蛋白质的快速提取，为该蛋白B链在医学和治疗领域上的应用提供了新的途径。

A Method for Producing Recombinant Castor Toxin Protein B Chain

【技术实现步骤摘要】
一种生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法
本专利技术涉及DNA重组技术、蛋白质的表达方法，尤其是涉及利用家蚕杆状病毒表达系统表达生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法。
技术介绍
蓖麻毒素是从蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64000。毒素由A和B两条多肽链组成，两链间由一个二硫键连接。目前，A链和B链的氨基酸序列以及二级结构已基本清楚。毒素B链由259个氨基酸组成，分子量大小30KDa，毒素B链上含有两个半乳糖或半乳糖残基结合位点，可和细胞表面的含半乳糖残基的受体结合，通过内陷作用进入细胞质，发挥毒性作用。蓖麻毒素B链易损伤肝、肾等实质器官，发生出血、变性、坏死病变。并能凝集和溶解红细胞，抑制麻痹心血管和呼吸中枢，是致死的主要原因之一。但目前最新的研究发现，该毒素具有诱导细胞凋亡的作用，因此，通过靶向作用，该毒素在肿瘤治疗领域有很好的应用前景。鉴于该毒素在蓖麻中的含量极低，加上提纯难度大，因此，十分有必要进行体外表达，开发一种高效且经济的方法进行生产。由于该毒素毒性大，如大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等表达水平较低，另外由于该蛋白需要糖基化，大肠杆菌等原核表达系统修饰差，在现有的表达系统中均无法实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法，其特征在于：(1)蓖麻毒素蛋白B链编码基因的克隆：以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板，利用RT‑PCR系统一步克隆获得蓖麻毒素蛋白B链基因的PCR产物；(2)含有蓖麻毒素蛋白B链基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1‑蓖麻毒素蛋白B链得到蓖麻毒素蛋白B链基因片段，然后将蓖麻毒素蛋白B链基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA‑蓖麻毒素蛋白B链；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内将重组体pBlueBacHisA‑蓖麻毒素蛋白B链与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)同源重组...

【技术特征摘要】
1.一种生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法，其特征在于：(1)蓖麻毒素蛋白B链编码基因的克隆：以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板，利用RT-PCR系统一步克隆获得蓖麻毒素蛋白B链基因的PCR产物；(2)含有蓖麻毒素蛋白B链基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-蓖麻毒素蛋白B链得到蓖麻毒素蛋白B链基因片段，然后将蓖麻毒素蛋白B链基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白B链；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内将重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白B链与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)同源重组产生重组病毒；(3)家蚕体内表达和重组蓖麻毒素蛋白B链：使用家蚕幼虫5龄起蚕，经口接种上述重组病毒进行感染表达，将涂布有病毒液的桑叶饲喂家蚕，然后在23-25℃下饲养；在饲养96小时后收集家蚕幼虫；从家蚕幼虫中收集血淋巴，用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得最终的重组蓖麻毒素蛋白B链蛋白。2.根据权利要求1所述的一种生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，利用RT-PCR系统一步克隆具体如下：引物设计如下：正向引物：5'-AGGGATCCGTTGATGGTTGTATG-3'，含有BamHI酶切位点，反向引物：5'-GAAGCTTGCAATAACTTGCTGTCCT-3'，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性2分钟；10个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；25个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟；然后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分离，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将PCR产物克隆入载体pCR2.1，获得pCR2.1-蓖麻毒素蛋白B链。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小锋，陈楠，张健家，沈运旺，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33