一种体内、外放射性小肠损伤模型的建立方法技术

本发明专利技术提供一种体内、外放射性小肠损伤模型的建立方法，本发明专利技术目的通过如下方法实现。常规小鼠，待体重稳定后分组，麻醉好的小鼠标记处剑突和肋骨下缘至股骨的腹腔照射靶区，电离辐射射线照射靶区，照射后3‑5天取样，最佳照射剂量为4～8Gy。本发明专利技术体内外模型可相互印证，小鼠小肠和人小肠粘膜上皮细胞辐射损伤所需照射剂量基本一致。基于小鼠和人体正常细胞的放射性小肠损伤模型可用于相应的防治药物筛选研究和系统评价体系建立。

Establishment of a model of radiation-induced intestinal injury in vivo and in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种体内、外放射性小肠损伤模型的建立方法
技术介绍
肠道的辐射敏感性极高，电离辐射后快速发生破坏，尤以小肠最为严重，大肠次之。无论是事故辐照、还是医疗辐照，肠道均可以导致放射性肠损伤。日本原子弹爆炸后，68％的遇难者和21％的幸存者均出现严重的腹痛、腹泻、粘液血便等放射性肠损伤的症状；临床接受腹盆腔放射治疗的恶性肿瘤患者中，近80％在放疗后出现恶心、呕吐、腹胀、粘液血便等不同程度的放射性肠损伤症状。然而，放射性肠损伤的防治仍然是当今的棘手问题。核事故医学应急救援和临床放射治疗迫切需要低毒、高效的放射性肠损伤防治药物。在新药研发过程中，客观可靠的放射性小肠损伤体内外模型和评价系统尚待建立与完善。现有的体内模型主要分为两种，一种为单次大剂量全身照射(≥8Gy)，其损伤多不可逆，且难以避免多系统衰竭所致动物死亡，现实应用时难以筛选出有效的放射性肠损伤防治药物。另一种为连续多次腹腔照射(2Gy/天，连续5天)，但造模时间长，不可控因素多。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种体内、外放射性小肠损伤模型的建立方法，本专利技术目的通过如下方法实现。常规小鼠，待体重稳定后分组，麻醉好的小鼠标记剑突和肋骨下缘至股骨的腹腔照射靶区，电离辐射射线照射靶区；照射后3-5天取样。具体地，小鼠进入动物房后饲养1天，待体重稳定后分组，适应性喂养3天，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠用苦味酸标记剑突和肋骨下缘至股骨的腹腔照射靶区后，平放到透明的独立固定盒中，至于水平树脂台上，以X射线或60Coγ射线照射靶区。电离辐射X射线的照射条件：源靶距1m，能量6MeV，剂量率400cGy/min；各组Balb/c小鼠腹腔分别接受2.0-12.0GyX射线的照射；60Coγ射线的照射条件：1Gy/min，源靶距1.05m；各组ICR小鼠腹腔分别接受2.0-8.0Gy60Coγ射线的照射；优选的照射剂量为4～8Gy。附图说明图1.Balb/c小鼠腹腔X射线照射图图2.小鼠腹盆腔X射线照射后第5天一般状态图图3.小鼠腹盆腔X射线照射后第5天腹腔解剖图图4.小鼠受到不同剂量X射线腹盆腔局部照射后小肠的病理改变图(H&E染色，40×)图5.60Coγ射线照射后小鼠小肠病理改变(H&E染色，100×)图6.不同辐照剂量照射后10天内HIEC-6细胞增殖能力的改变小肠粘膜代谢更新快，对电离辐射十分敏感，X射线和γ射线均属电离辐射。临床肿瘤放射治疗主要应用加速器产生的X射线,而核事故中γ射线的损害作用占有重要地位。相较于X射线，γ射线的波长更短、能量更大、频率更高、穿透能力更强、对生物的破坏力也更大。60Co在衰变时，可以释放出γ射线。机体受到照射后快速发生损伤。脑型、肠型和骨髓型急性放射病均可出现小肠粘膜的坏死。小肠粘膜上皮细胞的自发性再生潜力较大，修复速度较快。在受到电离辐射后，若小肠粘膜上皮细胞的自发再生与修复能力大幅降低，则放射性小肠损伤难以自行恢复，需要药物的干预。本专利技术放射性小肠损伤体内外模型是其发病机制和防治药物研究的必要工具，本专利技术体外模型的建立可推动放射性小肠损伤的发病机制研究，并有效加速放射性小肠损伤防治药物的筛选；体内模型的建立可进一步完善放射性小肠损伤防治药物的评价体系。在4～8Gy的照射剂量下，X射线单次腹腔照射可导致小鼠小肠放射性损伤；60Coγ射线单次腹腔照射可导致小鼠小肠放射性损伤；60Coγ射线单次照射可导致人小肠粘膜上皮细胞HIEC-6的增殖和再生能力减弱；体内外模型可相互印证，小鼠小肠和人小肠粘膜上皮细胞辐射损伤所需照射剂量基本一致。基于小鼠和人体正常细胞的放射性小肠损伤模型可用于相应的防治药物筛选研究和系统评价体系建立。实施例1X射线腹腔局部照射造成的小鼠放射性小肠损伤体内模型雄性Balb/c小鼠，进入动物房后饲养1天，待体重稳定后分组，适应性喂养3天，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠用苦味酸标记剑突和肋骨下缘至股骨的腹腔照射靶区后，平放到透明的独立固定盒中，至于水平树脂台上，以X射线照射靶区(如图1)。照射条件：源靶距1m，能量6MeV，剂量率400cGy/min。采用不同辐照剂量对小鼠腹腔进行局部照射，各组小鼠分别接受2.0、4.0、8.0、12.0、16.0Gy的照射。照射后，观察小鼠的一般状态、体重、饮食量、饮水量的改变，并于照射后第5天摘眼球采血，获得全血后，于4℃放置4h，待凝血后，3000rpm、4℃离心10min，将上层血清分离至一个新的1.5ml的离心管中，-20℃保存待测。采血后脱颈椎处死，剪开腹腔，取空肠(小鼠左上腹的小肠)2cm，浸入中性甲醛溶液中固定，常规方法包埋、切片、并制作HE染色病理切片。1.1X射线腹腔照射后小鼠一般状态分析0Gy组小鼠：与其他组小鼠同时进行麻醉和假照射，返回动物房后，5天内未见饮食、饮水量降低，体重未见下降，皮毛顺滑，反应灵敏，状态良好。2Gy组小鼠：照射后第4天至第5天可见饮食、饮水量微有降低，体重微有降低、个别出现黑色软便，皮毛顺滑，反应灵敏，状态基本良好。4Gy组小鼠：照射后第4天至第5天可见饮食减少、饮水量明显降低，体重下降，笼内垫料中便黑色。8Gy组小鼠：照射后第4天小鼠活动减少，同时出现饮食、饮水量降低，体重下降，个别出现弓背，状态变差，笼内垫料中便黑色；照射后5天，反应与第4天类似，小鼠状态更差，笼内垫料中便量减少。12Gy组小鼠：照射后第3天出现运动减少，饮食、饮水量降低，状态变差；照射后第4天出现目光无神、弓背、少食懒动、嗜睡，饮食、饮水减少，体重降低，笼内垫料中便黑色；照射后第5天反应进一步加重，便量减少，推测可能出现肠梗阻。16Gy组小鼠：照射后3天，出现目光无神、弓背、少食懒动、嗜睡，饮食、饮水减少，体重降低，偶尔可见小鼠“扭体”反应，其便呈暗黑色，5小鼠出现柏油样黑色粘液便。照射后4天，小鼠状态更萎靡，形容消瘦，笼内垫料中便量减至极少，推测肠毒性反应较前一天加重，可能出现肠梗阻。照射后第5天，1只小鼠死亡，其余8只状态极差。表1.小鼠腹盆腔照射后第5天的体重、饮食量、饮水量1.2X射线腹腔照射后小鼠肠道宏观病理改变0Gy组小鼠：肠道结构正常、状态良好，肠壁润泽，可见完整的小血管与毛细血管分布。2Gy组小鼠：小肠肠壁红肿、增厚、变硬，2只小鼠小肠内可见水样淡黄色液体，肠壁血管弥散。4Gy组小鼠：小肠红肿段总长度增加，肠壁变厚、变硬，肠粘膜可见节段性水肿，肠壁血管弥散。8Gy组小鼠：小肠充血，肠粘膜可见严重的节段性水肿，1只小鼠出现肠壁粘连。12Gy组小鼠：肠道结构紊乱，肠壁变厚、变硬、充血，局部出血、坏死，肠粘膜高度水肿，小肠、大肠均呈暗褐色，腔内含大量便液，局部可见黑色梗阻。16Gy组小鼠：肠道结构紊乱，广泛性出血、坏死，小肠壁肿胀、变薄且近乎透明，透过小肠壁可见黄色或褐色粘液，肠粘膜高度水肿，肠内可见大面积的黑色血块状梗阻。1.3X射线腹腔照射后小鼠小肠镜下病理改变小鼠小肠光镜下分为4层：粘膜层、粘膜下层、肌层、浆膜层。粘膜层由许多凸起的小肠绒毛和肠腺组成。绒毛上皮由吸收细胞、杯状细胞和少量内分泌细胞构成，大部分为单层柱状吸收细胞。粘膜上皮细胞下陷至固有层形成管状的肠腺，亦称肠隐窝。肠隐窝上皮的构成与绒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体内放射性小肠损伤模型的建立方法，其特征在于该方法为：常规小鼠，待体重稳定后分组，麻醉好的小鼠标记处剑突和肋骨下缘至股骨的腹腔照射靶区，电离辐射射线照射靶区；照射后3‑5天取样。

【技术特征摘要】
2019.02.24 CN 20191013493511.一种体内放射性小肠损伤模型的建立方法，其特征在于该方法为：常规小鼠，待体重稳定后分组，麻醉好的小鼠标记处剑突和肋骨下缘至股骨的腹腔照射靶区，电离辐射射线照射靶区；照射后3-5天取样。2.如权利要求1所述的一种体内放射性小肠损伤模型的建立方法，其特征在于该方法为：Balb/c小鼠，进入动物房后饲养1天，待体重稳定后分组，适应性喂养3天，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠用苦味酸标记处剑突和肋骨下缘至股骨的腹腔照射靶区后，平放到透明的独立固定盒中，至于水平树脂台上，以X射线或60Coγ射线照射靶区。3.如权利要求1或2之一所述的方法，其特征在于该方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵帅，苏旭，高月，田梅，刘建香，苟巧，王春燕，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11