血红蛋白的糖化率测定方法技术

本发明专利技术提供一种糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序：使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触的工序；使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢的工序；使上述工序中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素的工序；测定上述工序中得到的显色色素的显色量的工序；和，将上述工序中得到的显色量代入校准曲线而计算糖化血红蛋白比率的工序，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的、糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。

Method for determination of glycosylation rate of hemoglobin

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血红蛋白的糖化率测定方法
本专利技术涉及血红蛋白的糖化率的测定方法。更详细而言，涉及利用酶反应测定血液等生物试样中的糖化血红蛋白的比例的方法、和用于该方法的组合物。
技术介绍
作为糖尿病的标志物之一，正在利用HbA1c等糖化血红蛋白。HbA1c是在血红蛋白的β链N末端的缬氨酸的氨基上键合有葡萄糖的糖化血红蛋白。在使用糖化血红蛋白作为糖尿病标志物时，算出血红蛋白的糖化率、即糖化血红蛋白浓度相对于总血红蛋白浓度的比率(后文也记作“糖化血红蛋白比率”。)并在诊断中使用。例如，HbA1c浓度相对于总血红蛋白浓度的比率(后文也记作“HbA1c比率”。)与血中的葡萄糖量相比，其量不会剧烈变动且与1～2个月前的血糖值相关性良好，因此作为糖尿病的指标是优异的。目前，作为糖化血红蛋白比率的测定方法，高效液相色谱(HPLC)法、胶乳凝集免疫比浊法已经普及。HPLC法存在色谱柱价格高昂、另外处理能力低的问题。另外，胶乳凝集免疫比浊法存在会污染测定中所用的分析装置的反应槽、维护费工夫的问题。因此，解决了这些问题的酶法近年来得到关注、普及。在测定糖化血红蛋白比率时，作为酶法的代表性方法为下述方法：通过非酶反应测定总血红蛋白浓度，另行通过酶反应测定糖化血红蛋白浓度后，由计算式算出糖化血红蛋白比率。作为总血红蛋白浓度的测定方法，可列举作为国际标准法的氰化高铁血红蛋白法、氯化血红素法、碱性血红素法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法、Hb·red测量法或HbCO测量法等。总血红蛋白浓度如下算出：使用浓度已知且总血红蛋白浓度不同的2种校准品制作总血红蛋白浓度的校准曲线，接着测定试样中的总血红蛋白量，使用上述校准曲线算出总血红蛋白浓度。另一方面，糖化血红蛋白浓度测定方法为下述比色定量法：使氧化还原酶与糖化血红蛋白或其分解产物反应而生成过氧化氢，再使该过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物反应而测定显色量(专利文献1)。糖化血红蛋白浓度如下算出：使用浓度已知且糖化血红蛋白浓度不同的2种校准品制作糖化血红蛋白浓度的校准曲线，接着测定试样中的糖化血红蛋白量，使用上述校准曲线算出糖化血红蛋白浓度。例如，在选择HbA1c作为糖化血红蛋白的情况下，糖化HbA1c比率可以通过将上述反应中得到的总血红蛋白浓度、糖化血红蛋白浓度代入以下的计算式而算出。HbA1c(NGSP)值＝0.0915×HbA1c浓度(mmol/L)/总Hb浓度(mol/L)+2.15HbA1c(JDS)值＝0.980×HbA1c(NGSP)值-0.245因此，将基于酶法的HbA1c比率测定方法应用于自动分析仪的情况下，需要测定总血红蛋白的通道和测定HbA1c的通道这2通道，因此需要2通道量的试剂，变得烦杂。另外，由于进行2种测定，HbA1c比率的测定处理速度比使用1通道进行1种测定的方法低。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第4427137号
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术是以所述现有技术的课题为背景作出的。即，本专利技术的目的在于，提供使用酶法测定糖化血红蛋白比率的方法的改进，使其更简便、更迅速和/或更准确；和/或，用于上述测定方法的校准品、试剂组合物等。用于解决问题的方案本专利技术人们进行了深入研究，结果发现，通过以下所示的手段可以解决上述课题，从而完成了本专利技术。虽然不希望被理论约束，但是推测：在本专利技术中，通过使具有磺基的化合物与血红蛋白接触从而使血红蛋白分子中所含的2价的铁离子被部分氧化，还原能力以规定的比例减弱，该还原能力减弱的血红蛋白会与其量相适应地使糖化氨基酸氧化酶等对于糖化血红蛋白的酶反应中所产生的过氧化氢的浓度降低，从而通过在过氧化物酶存在下的过氧化氢与显色底物的反应所得到的显色量、与糖化血红蛋白比率之间产生强相关关系。并且本专利技术人们还发现：对于该强相关关系而言，通过使用2个水平以上的以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品作为校准品、并且使它们的总血红蛋白浓度达到规定的比率，从而相关关系可进一步提高。即，本专利技术包含以下的构成。[项1]一种糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序(1)～(5)：工序(1)，使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触；工序(2)，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢；工序(3)，使工序(2)中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素；工序(4)，测定工序(3)中得到的显色色素的显色量；和，工序(5)，将工序(4)中得到的显色量代入校准曲线，算出糖化血红蛋白比率，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的、糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。[项2]根据项1所述的测定方法，其中，作为所述工序(5)中使用的糖化血红蛋白校准品，使用以2个水平以上的糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品，将测定结束时的反应液中的总血红蛋白浓度最低者设为1时，其他者的总血红蛋白浓度为其1倍～6倍的浓度。[项3]根据项1或2的测定方法，其还包括以下的工序(6)：工序(6)，通过蛋白酶的作用，将糖化血红蛋白分解成糖化血红蛋白分解物。[项4]根据项1～3中任一项所述的测定方法，其还包括以下的工序(7)：工序(7)，使包含糖化血红蛋白的试样溶血。[项5]根据项1～4中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由苯磺酸、烷基磺酸、萘磺酸、磺基琥珀酸、苯并噻唑啉磺酸、蒽醌磺酸、樟脑磺酸、苯并噁二唑磺酸、和它们的衍生物、以及它们的盐组成的组中的至少1种化合物。[项6]根据项1～5中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由十二烷基苯磺酸、3-氨基苯磺酸、烷基二苯基醚磺酸、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸、4-氨基-4’-硝基茋-2,2’-二磺酸、4,4’-二偶氮茋-2,2’-二磺酸、对氨基苯磺酸、5-磺基间苯二甲酸、5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸、烷基萘磺酸、2-萘磺酸、8-氨基-1-萘磺酸、十二烷基萘磺酸、磺基琥珀酸二-2-乙基己酯、二烷基磺基琥珀酸、和它们的盐组成的组中的至少1种化合物。[项7]根据项1～6中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为隐色型色原体。[项8]根据项1～7中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为吩噻嗪系的隐色型色原体。[项9]根据项1～8中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为选自由10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪、和10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪组成的组中的至少1种吩噻嗪系的隐色型色原体。[项10]根据项1～9中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐。[项11]根据项1～10中任一项所述的测定方法，其以1通道实施。[项12]一种糖化血红蛋白比率的测定试剂盒，其包含以下的试剂(a)～(e)：试剂(a)，其含有具有磺基的化合物；试剂(b)，其含有糖化氨基酸氧化酶；试剂(c)，其含有过氧化物酶；试剂(d)，其含有在过氧化物酶存在下与过氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序(1)～(5)：工序(1)，使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触；工序(2)，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢；工序(3)，使工序(2)中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素；工序(4)，测定工序(3)中得到的显色色素的显色量；和，工序(5)，将工序(4)中得到的显色量代入校准曲线，算出糖化血红蛋白比率，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的、糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.30 JP 2016-232613;2016.11.30 JP 2016-232611.一种糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序(1)～(5)：工序(1)，使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触；工序(2)，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢；工序(3)，使工序(2)中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素；工序(4)，测定工序(3)中得到的显色色素的显色量；和，工序(5)，将工序(4)中得到的显色量代入校准曲线，算出糖化血红蛋白比率，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的、糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，作为所述工序(5)中使用的糖化血红蛋白校准品，使用以2个水平以上的糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品，将测定结束时的反应液中的总血红蛋白浓度最低者设为1时，其他者的总血红蛋白浓度为其1倍～6倍的浓度。3.根据权利要求1或2的测定方法，其还包括以下的工序(6)：工序(6)，通过蛋白酶的作用，将糖化血红蛋白分解成糖化血红蛋白分解物。4.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其还包括以下的工序(7)：工序(7)，使包含糖化血红蛋白的试样溶血。5.根据权利要求1～4中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由苯磺酸、烷基磺酸、萘磺酸、磺基琥珀酸、苯并噻唑啉磺酸、蒽醌磺酸、樟脑磺酸、苯并噁二唑磺酸、和它们的衍生物、以及它们的盐组成的组中的至少1种化合物。6.根据权利要求1～5中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由十二烷基苯磺酸、3-氨基苯磺酸、烷基二苯基醚磺酸、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸、4-氨基-4’-硝基...

【专利技术属性】
技术研发人员：松尾美穗，前原志穗里，
申请(专利权)人：东洋纺株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP