具有提高的生物活性和降低的对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解易感性的来源于纤连蛋白的肽制造技术

提出了来源于纤连蛋白的多肽，其具有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性，并且能够结合生长因子和/或增强生长因子活性。这些多肽可用于增强患者中的伤口愈合。

Fibronectin-derived peptide with enhanced biological activity and reduced susceptibility to neutrophil elastase degradation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有提高的生物活性和降低的对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解易感性的来源于纤连蛋白的肽政府支持本专利技术是在美国陆军AFIRM1和JWMRPS14授予的政府支持下分别在授权号W81XWH-08-2-0034和W81XWH-15-C-0043下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
本专利技术基于来源于纤连蛋白的多肽的发现，所述多肽具有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性，并且能够结合生长因子和/或增强生长因子活性。之前已知的具有增强生长因子活性能力的来源于纤连蛋白的多肽被发现易于被人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解，从而降低了它们在体内使用的有效性。本专利技术涉及对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的降解具有增加抗性的新型生长因子增强多肽。本专利技术还涉及此类化合物在美容治疗及伤口和癌症治疗中的用途。背景在美国平民中，每年约有500,000名烧伤患者出现在急诊室。在每年40,000例入院中，25,000名烧伤患者被送往专门的烧伤中心。烧伤的逐步扩展会产生破坏性影响。在几天到一周的时间内，深二度烧伤可能变成三度烧伤，这在短期内会导致组织损失增加、愈合时间延长、发病率和死亡率过高。从长期来看，瘢痕形成增加、伤口挛缩和生活质量下降成为主要问题。虽然导致缺血区转变为完全坏死的一个或多个确切机制尚不清楚，但是由炎症以及缺血/再灌注引起的几种过程(包括氧化剂和细胞因子应激)可能起作用。改善血流的疗法，如非甾体抗炎剂(NSAIDS)和抗凝血剂(肝素)在防止烧伤进展方面没有显示出实质性的益处。因此，限制烧伤进展的疗法是未满足的需求。有证据表明纤连蛋白(FN)参与许多生物过程，包括组织修复、胚胎形成、血液凝固、细胞迁移、伤口修复和细胞粘附。纤连蛋白有两种主要形式。第一种是不溶的糖蛋白二聚体，其在胞外基质(ECM)中用作接头；第二种是存在于血浆中的可溶的二硫键连接的二聚体。纤连蛋白的ECM形式由成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞和某些上皮细胞表达。纤连蛋白的血浆形式由肝细胞表达。纤连蛋白可以通过将细胞锚定至胶原蛋白或蛋白聚糖底物而起一般的细胞粘附分子的作用。纤连蛋白还可以通过结合ECM的组分和细胞表面上的膜结合纤连蛋白受体而在组织细胞相互作用方面起作用。纤连蛋白的形式存在于脊椎动物中，包括哺乳动物、鸟类、两栖动物、鱼类和爬行动物。FN为一种500kDa糖蛋白，在血液中循环，并且在组织形成期间由组织细胞在临时胞外基质(ECM)中产生和沉积。作为临时ECM的关键组分，FN在胚胎形成、形态发生和伤口愈合中起着至关重要的作用，但在烧伤患者的伤口和血液中缺乏。已知FN在烧伤创面液中通过内肽酶嗜中性粒细胞弹性蛋白酶被降解。参见Grinnell等人，IdentificationofNeutrophilElastaseastheProteinaseinBurnWoundFluidResponsibleforDegradationofFibronectin,JInvest.Dermatology,1994,103(2):155-61。先前公开的肽“P12”是在纤连蛋白(FN)第一类型III重复蛋白(FNIII1)的β-折叠片的免疫球蛋白夹心型内隐蔽的14-残基肽。与FN不同，溶液中的P12与各种生长因子，特别是血小板来源的生长因子-BB(PDGF-BB)固有地且协同地促进间充质细胞生长、增殖和迁移。此外，P12在PDGF-BB存在下保护成年人皮肤成纤维细胞(AHDF)免受氧化和细胞因子应激和/或营养物撤出诱导的细胞死亡。P12还限制了大鼠和猪烧伤模型中的烧伤进展，并减轻了垂直烧伤进展猪模型中的瘢痕形成。参见，如，PCT/US2006/038778；美国专利8,759,300；Lin,等人,FibronectinpeptidesthatbindPDGF-BBenhancesurvivalofcellsandtissueunderstress,JInvestDermatol.2014年4月；134(4):1119–1127；和Asif,等人,BloodVesselOcclusioninPeri-burnTissueisSecondarytoErythrocyteAggregationandMitigatedbyaFibronectin-derivedPeptidethatLimitsBurnInjuryProgression,WoundRepReg(2016)24501-513。特别地，纤连蛋白的片段PSHISKYILRWRPK，或“P12”在Lin等人和Asif等人中均被公开为可用于治疗伤口，特别是治疗烧伤。概要我们提出了用于治疗伤口的来源于纤连蛋白片段的嗜中性粒细胞弹性蛋白抗性肽。特别地，我们发现先前公开的纤连蛋白的生物活性肽片段如P12易于在体外被嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解，并且在局部应用至伤口时不会促进愈合。甚至先前公开的纤连蛋白的生物活性肽片段的环化形式如环状P12仍然对该内肽酶敏感。我们提出了纤连蛋白的片段和/或片段衍生物的肽，其维持它们结合生长因子如血小板来源的生长因子-BB(PDGF-BB)以及增强成纤维细胞存活的生物活性，并且还被修饰以提高它们在体外和体内被嗜中性粒细胞弹性蛋白酶降解的抗性。在本专利技术的一些实施方案中，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性肽是根据式I的直链或环状多肽：(I)：H–X1-X2–K–Y–X3–X4–R–W–R–P–K–X5–X6–X7其中X1是I或G或L，X2是S或G，X3是I或G或L，X4是L或G，X5是N或G，X6不存在或是S，且X7不存在或是V；并且其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN。本专利技术的另外实施方案包括HISKYILRWRPKNSV(P46)、HIGKYGLRWRPKNSV(cNP7)、HIGKYGLRWRPKGSV(cNP8)、HGSKYGLRWRPKNSV、HIGKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKGSV以及它们的环化形式。我们还提出了使用这些肽进行美容治疗以及伤口和心血管疾病治疗的方法。待治疗的伤口包括患者皮肤、黏膜、结缔组织、筋膜、韧带、肌腱、软骨、神经或肌肉的手术切口或摘除、创伤性损伤、热烧伤、化学烧伤、病变或溃疡及患者骨骼的伤口。治疗的伤口可以是感染的或未感染的。待治疗的心血管事件包括血管被红细胞和/或纤维蛋白原和/或纤维蛋白的聚集体堵塞，如可发生在烧伤创面；心肌梗死；多器官衰竭；糖尿病；镰状细胞贫血；真性红细胞增多症；和血纤维蛋白原过多。在一个具体的实施方案中，本专利技术的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性肽用于治疗热烧伤和/或化学烧伤。本专利技术的特征还在于包含本专利技术的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抗性肽的组合物(如，生理上可接受的组合物)。生理上可接受的组合物可以是促进治疗反应的药物组合物。如上所述，美容组合物也是特征性的，并且可包含本文所述的肽。本专利技术的组合物也可以在这样的意义中是非药物性的：它们可以包含浓缩肽和/或其他成分，其应当在使用前被稀释或以其他方式修饰(如，与其他活性或非活性成分混合)(如，在细胞培养物中或者作为美容或治疗制剂)。附图简述图1是cP12对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的易感性的图解。图1A：将cP12与纯化的人嗜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.根据式I的多肽：(I)：H–X1‑X2–K–Y–X3–X4–R–W–R–P–K–X5–X6–X7其中X1是I或G或L，X2是S或G，X3是I或G或L，X4是L或G，X5是N或G，X6不存在或是S，且X7不存在或是V；并且其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN，其中所述多肽被以下中的至少一种任选取代：N‑末端的低级酰基，C‑末端的取代或未取代的低级烷基‑、烯基‑、炔基‑或卤代烷基‑胺基团及聚乙二醇，其中所述多肽还任选为在式I的每条独立确定的序列之间具有任选接头的式I的直链或支链多聚体；或其环化形式。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.14 US 62/408,2221.根据式I的多肽：(I)：H–X1-X2–K–Y–X3–X4–R–W–R–P–K–X5–X6–X7其中X1是I或G或L，X2是S或G，X3是I或G或L，X4是L或G，X5是N或G，X6不存在或是S，且X7不存在或是V；并且其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN，其中所述多肽被以下中的至少一种任选取代：N-末端的低级酰基，C-末端的取代或未取代的低级烷基-、烯基-、炔基-或卤代烷基-胺基团及聚乙二醇，其中所述多肽还任选为在式I的每条独立确定的序列之间具有任选接头的式I的直链或支链多聚体；或其环化形式。2.如权利要求1所述的多肽，其不是式I的直链或支链多聚体。3.如权利要求2所述的多肽，其选自：HISKYILRWRPKNSV(P46)、HIGKYGLRWRPKNSV(NP7)、HIGKYGLRWRPKGSV(NP8)、HGSKYGLRWRPKNSV、HIGKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKGSV以及它们的环化形式。4.如权利要求3所述的多肽，其选自HIGKYGLRWRPKGSV(NP8)及其环化形式。5.组合物，其包含：根据式I的多肽：(I):H–X1-X2–K–Y–X3–X4–R–W–R–P–K–X5–X6–X7其中X1是I或G或L，X2是S或G，X3是I或G或L，X4是L或G，X5是N或G，X6不存在或是S，且X7不存在或是V；并且其中所述多肽的前13个氨基酸中没有连续两个氨基酸不同于序列HISKYILRWRPKN，其中所述多肽被以下中的至少一种任选取代：N-末端的低级酰基，C-末端的取代或未取代的低级烷基-、烯基-、炔基-或卤代烷基-胺基团及聚乙二醇，其中所述多肽还任选为在式I的每条独立确定的序列之间具有任选接头的式I的直链或支链多聚体；或其环化形式；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，其中所述组合物适用于选自向患者注射、静脉内施用和局部施用的施用途径。6.如权利要求5所述的组合物，其中所述多肽不是式I的直链或支链多聚体。7.如权利要求6所述的组合物，其中所述多肽选自：HISKYILRWRPKNSV(P46)、HIGKYGLRWRPKNSV(NP7)、HIGKYGLRWRPKGSV(NP8)、HGSKYGLRWRPKNSV、HIGKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKNSV、HGSKYIGRWRPKGSV以及它们的环化形式。8.如权利要求7所述的组合物，其中所述多肽选自HIGKYGLRWRPKGSV(NP8)及其环化形式(...

【专利技术属性】
技术研发人员：理查德·奥古斯特·克拉克，蔺福宝，
申请(专利权)人：尼优美特里克斯医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US