一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种菌黄素合成相关基因XC_4092，基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物具有3‑酮脂酰ACP还原酶活性，能够催化菌黄素合成中的还原反应。本发明专利技术进一步的公开了基因XC_4092在生产无色黄原胶方面的应用，以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株Xcc8004作为出发菌株，通过失活Xcc8004基因组中的基因XC_4092完成基因改造，构建产无色黄原胶工程菌。相较Xcc8004，本发明专利技术的工程菌在发酵过程中不能合成菌黄素，有效地改善了黄原胶的外观颜色，从而大大地提升了黄原胶产品的品质。

A Gene Related to Bacterioflavin Synthesis and Its Application in Construction of Engineering Bacteria Producing Colorless Xanthan Gum

【技术实现步骤摘要】
一种菌黄素合成相关基因及其在构建产无色黄原胶工程菌中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的菌黄素合成基因，以及该菌黄素合成基因在构建产无色黄原胶工程菌中的应用。
技术介绍
黄原胶是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc）产生的胞外多糖聚合物，是已经开发的微生物多糖中应用范围最为广泛的一种，其具有良好的增粘性和触变性，对热、酸、碱稳定性高，能够与多种溶剂相容。目前，黄原胶作为助悬剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂等，应用于医药、食品、饮料、化妆品、洗涤剂、石油开采等领域中。菌黄素是黄单胞菌属的重要代谢产物，其为溴化芳基多烯脂类衍生物，具有抗氧化、避免菌体遭受光照损害的功能。菌黄素不溶于水，能够与细胞外膜牢固结合，使得菌落颜色为黄色。在生产黄原胶工艺中，由于黄原胶产品质量标准的要求，需要去除发酵过程中产生的菌体细胞色素，而菌黄素是菌体细胞色素的主要成分，目前，行业内通常采用溶剂化学反应法去除细胞色素，存在着溶剂耗量大、操作繁琐、生产成本高的问题，因而去除细胞色素步骤成为制约黄原胶品质提升以及节约生产成本的重大障碍。因此，拟通过阻断野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的菌黄素合成途径来解决上述问题，从而改善黄原胶产品的外观颜色，节约生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：一方面公开一种与菌黄素合成相关的新基因（XC_4092）；另一方面是针对新基因（XC_4092），对黄原胶产生菌株（野油菜黄单胞菌野油菜致病变种）进行遗传改造，降低发酵生产过程中菌黄素的合成量，从而提高黄原胶产品品质，节约生产成本。本专利技术公开了一种与菌黄素合成相关的基因，即：3-酮脂酰ACP还原酶基因（XC_4092），XC_4092的基因序列如SEQIDNO.1所示，由738个核苷酸组成，自5’端的第1~3位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自3’端的第736~738位核苷酸为该基因的终止密码子TGA。XC_4092基因编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，包括245个氨基酸，分子量为24982道尔顿，等电点为7.21；3-酮脂酰ACP还原酶能够催化菌黄素合成中的还原反应。本专利技术进一步的公开了基因XC_4092在生产无色黄原胶方面的应用，由于XC_4092基因编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，能够催化菌黄素合成中的还原反应，因此，通过对黄原胶产生菌进行遗传改造来阻断这个还原反应途径，从而阻断菌黄素的合成，进而能够生产无色黄原胶。本专利技术进一步地公开了基因XC_4092在构建生产无色黄原胶工程菌方面的应用。具体包括如下技术方案：本专利技术提供了一种生产无色黄原胶的工程菌，其中，出发菌株为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株Xcc8004，通过失活Xcc8004基因组中的基因XC_4092完成基因改造。进一步的，所述失活的方式为删除或沉默抑制基因XC_4092的全部或部分编码框。进一步的，生产无色黄原胶的基因工程重组菌是通过采用两次同源重组的基因敲除方法删除所述的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_4092所得。进一步的，利用两次同源重组的基因敲除方法构建生产无色黄原胶的基因工程重组菌具体包括如下步骤：S1、构建基因敲除重组质粒；S2、将步骤S1获得的重组质粒转化E.coliS17-1感受态细胞，获得转化子；S3、采用接合转移方式将重组质粒导入至野油菜黄单胞菌Xcc8004中，通过卡那霉素和利福平抗性培养基筛选，获得第一次同源重组菌；S4、将步骤S3中得到的第一次同源重组菌株进行第二次同源重组培养，利用复制平板法筛选第二次同源重组菌；S5、PCR法验证步骤S4中得到的第二次同源重组菌，将扩增片段测序，确认需要敲除的基因XC_4092已被删除，成功删除基因XC_4092的第二次同源重组菌即为生产无色黄原胶的基因工程重组菌。进一步的，所述的步骤S1为：以野油菜黄单胞菌Xcc8004的基因组为模板，利用PCR法分别扩增XC_4092基因的上游片段和下游片段，其中，上游片段的引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，下游片段的引物序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；接着，采用融合PCR法，以XC_4092基因的上、下游片段为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.6为引物，将XC_4092基因的上、下游片段连接起来，形成XC_4092基因的缺失片段；再将XC_4092基因的缺失片段酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB，获得重组质粒。进一步的，所述的步骤S5中，PCR验证引物序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。进一步的，所述的步骤S5中，验证PCR的程序包括如下：（1）95℃预变性10min；（2）95℃变性1min；（3）56℃退火30s；（4）72℃延伸2.0min；（5）重复（2）～（4）35个循环；（6）72℃，10min。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种与菌黄素合成相关的新基因（XC_4092），可用于黄原胶生成菌株的遗传改造，达到降低发酵生产中菌黄素的合成量、改善黄原胶外观品质的目的。XC_4092基因编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，能够催化菌黄素合成中的还原反应。同时，通过采用现代分子生物学技术对野油菜黄单胞菌Xcc8004进行定向改造，采用两次同源重组的方式删除Xcc8004基因组中的基因XC_4092，以获得产无色黄原胶的基因工程菌。本专利技术在国内尚属首例，通过阻断菌黄素合成途径中重要的还原反应，以不能合成菌黄素来改变目前行业内去除黄原胶中菌体细胞色素难的困境，有效地提升了黄原胶产品品质，简化了生产工艺流程，节约了生产成本。附图说明图1为实施例3中步骤S4的验证PCR扩增片段琼脂糖凝胶电泳图。图2为实施例4中Xcc8004和XccYH1在NYG平板上的菌落图。图3为实施例5中Xcc8004和XccYH1的菌体细胞经过处理后的吸收曲线图。具体实施方式下面结合附图和具体的实施例对本专利技术作进一步说明，但不限定本专利技术的范围。以下为实施例中涉及到的试剂与材料：（1）LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L；（2）NYG液体培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L；（3）10%蔗糖NYG液体培养基：蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L，蔗糖100g/L；（4）限制性内切酶、DNA连接酶、pMD19-T载体、自杀质粒pK18mobsacB、大肠杆菌S17-1等试剂购自宝日医生物技术（北京）有限公司；（5）PCR引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司；（6）野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004源自华南农业大学保藏中心。野油菜黄单胞菌的野生菌株Xcc8004具有利福平抗性。需要说明的是，若对（1）～（3）配置固体培养基时，需添加15g/L的琼脂粉；此外，（1）～（3）制备抗性培养基时，卡那霉素（Km）的工作浓度为30µg/mL，利福平（Rif）的工作浓度为50µg/mL。实施例1：XC_4092基因的克隆本实施例公开了XC_4092基因的克隆方法，包括如下步骤：S1、根据XC_4092本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菌黄素合成相关基因XC_4092，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因XC_4092编码产物具有3‑酮脂酰ACP还原酶活性，基因XC_4092编码产物氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种菌黄素合成相关基因XC_4092，其特征在于，基因序列如SEQIDNO.1所示；所述的基因XC_4092编码产物具有3-酮脂酰ACP还原酶活性，基因XC_4092编码产物氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的基因XC_4092在生产无色黄原胶方面的应用。3.根据权利要求1所述的基因XC_4092在构建生产无色黄原胶工程菌方面的应用。4.一种生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，是将野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_4092失活所得。5.根据权利要求4所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，所述失活的方式为删除或沉默抑制基因XC_4092的全部或部分编码框。6.根据权利要求4或5所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，是通过采用两次同源重组的基因敲除方法删除所述的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_4092所得。7.根据权利要求6所述的生产无色黄原胶的基因工程重组菌，其特征在于，由包括如下步骤的方法构建得到：S1、构建基因敲除重组质粒；S2、将步骤S1获得的重组质粒转化E.coliS17-1感受态细胞，获得转化子；S3、采用接合转移方式将重组质粒导入至野油菜黄单胞菌Xcc8004中，通过卡那霉素和利福平抗性培养基筛选，获得第一次同源重组菌；S4、将步骤S3中得到的第一次同源重组菌株进行第二次同源重组培养，利用复制平板法筛选第二次...

【专利技术属性】
技术研发人员：余永红，王海洪，马建荣，
申请(专利权)人：广东食品药品职业学院，
类型：发明
国别省市：广东,44