一种新支流呼四联灭活疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、H9亚型禽流感、肉鸡呼肠孤四联灭活疫苗，本发明专利技术所提供的四联灭活疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白；其中肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。目前市场上出售的呼肠孤病毒灭活疫苗及本发明专利技术疫苗对SPF鸡分别进行免疫，再用本发明专利技术的SD18株及其它分离毒进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明专利技术的灭活疫苗的免疫效果。

A New Tributary Respiratory Quadruple Inactivated Vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种新支流呼四联灭活疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒和鹅肉鸡呼肠孤病毒四联灭活疫苗。
技术介绍
鸡新城疫具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)感染可导致雏鸡、肉鸡发育缓慢，产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE将其列为B类疫病。禽流感是由A型流感病毒引起的、主要流行于动物和人类中的一种死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，并且经常变异，对人类和养禽业危害很大。禽呼肠孤病毒(ARV)属于呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属，Ⅱ亚群(融合性呼肠孤病毒)，病毒粒子的基因组为双链RNA，有10个节段，无囊膜，具有双层衣壳结构，主要引起病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合症及吸收不良综合症等，尤为严重的是诱发免疫抑制，造成机体对疫苗免疫应答能力和各种病原体抵抗力降低。1954年，美国的Fahey和Grawley首次从病鸡呼吸道分离后被确诊，1957年Olson对雏鸡的腱鞘炎作了报道，并分离到了病毒。1960年在英国，1970年在美国先后发现，而后在意大利、荷兰、日本、匈牙利等相继报道了病毒性关节炎病例。我国在1985年首先发病，四川、河北、北京、黑龙江、上海、广东、吉林、云南、贵州、河南、山东、河北等地发现本病，并从病例中分离到病毒。近年来，我国大多数省、区、市都有ARV感染的报道，其鸡群感染率可高达50％以上，已经成为鸡场中禽类免疫抑制病的主要诱因，严重危害养禽业的发展。完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、H9亚型禽流感、肉鸡呼肠孤四联灭活疫苗，所提供的疫苗具有高效、安全性好、抗体整齐度高、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。本专利技术在进行大量的流行病学调查，筛选获得了一株变异的肉鸡呼肠孤毒株，用分子生物学方法对分离到的新的肉鸡呼肠孤病毒进行改造，获得表达肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的大肠杆菌基因工程菌XL。将鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、H9亚型禽流感病毒及表达肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的大肠杆菌基因工程菌XL株分别培养，收获、灭活后将四种抗原混合，加入矿物油佐剂混合乳化制成四联灭活疫苗。用于预防鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽流感病毒、肉鸡呼肠孤。本专利技术所提供的四联灭活疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白；其中肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1；其中鸡新城疫病毒每0.1ml病毒含量≥109.0EID50；鸡传染性支气管炎病毒每0.1ml病毒含量≥106.7EID50、H9亚型禽流感病毒每0.1ml病毒含量应≥109.0EID50；肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的含量不低于400μg/ml。作为实施例的一种具体记载，其中鸡新城疫病毒为鸡新城疫病毒LaSota株；作为实施例的一种具体记载，其中鸡传染性支气管炎病毒为鸡传染性支气管炎病毒M41株；其中禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒QDY株，于2015年4月29日保藏在中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201517。其中肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白是由大肠杆菌基因工程菌XL(EscherichiacoliXL)株表达的，于2019年01月18日保藏在中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019058。本专利技术经大量的流行病学调查研究筛选、经血凝特性、理化特性、血清学、群特异性、型特异性、PCR检测及基因测序等鉴定出来的一株新的具有典型病变的毒株，能够抵挡住现流行的鸡呼肠孤病毒攻击的毒株。然后用分子生物学方法针对分离到的肉鸡呼肠孤病毒流行株SigmaC蛋白，构建表达SigmaC蛋白的大肠杆菌基因工程菌。在传统灭活工艺研究的基础上摸索出适合大肠杆菌基因工程菌表达的肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的灭活方法。利用疫苗佐剂，通过多次试验总结出四联苗规模化生产的乳化工艺参数，使得该疫苗的效果高于其它相关市售疫苗。具体实施方式申请人筛选获得了一株新型变异的肉鸡呼肠孤病毒，将该病毒编码SigmaC蛋白的基因克隆到pET28a表达载体，转化大肠杆菌E.coliBL21经诱导表达获得SigmaC蛋白，与鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒及H9亚型禽流感病毒混合制备成疫苗，从而促成了本专利技术。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：SigmaC蛋白编码序列的扩增及序列分析2018年在山东省多个种鸡场出现了肉鸡跗关节肿胀、发青、行动异常、撇退、瘫痪等的症状，而发病鸡群之前已经注射了已有的病毒性关节炎相关疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行肉鸡呼肠孤病毒的筛选。最终筛选出了一株肉鸡呼肠孤病毒SD18株；已经于2019年2月20日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为保藏编号为CCTCCNO:V201910。将鸡呼肠孤病毒SD18株和鸡呼肠孤病毒经典株S1133株经继代和纯化按上述方法制成灭活疫苗，分别免疫21日龄SPF鸡，免疫剂量0.5ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，三免后2周进行采血分离血清。将SD18株、S1133株病毒液分别稀释至200TCID50/0.1ml，逐一与SD18株和S1133株的阳性血清等体积混合，37℃震荡中和1小时后，每个中和组接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.2ml/枚，每隔24h照胚一次，弃掉24h以内死亡的鸡胚，连续观察至168小时。结果发现用SD18株阳性血清与SD18株病毒中和后接种的5枚SPF鸡胚均无死亡；用S1133株的阳性血清与SD18株病毒中和后鸡胚出现死亡；病毒对照组鸡胚4/4死亡。结果表明的SD18毒株作为抗原制备的阳性血清对其自身的中和能力明显好于S1133毒株制备的阳性血清。考虑到点突变的快速积累是RNA病毒的一个代表性特征，由基因重组而引起的抗原漂移在ARV中时有发生，最终导致新的毒株出现和疫苗失效。在ARV的8个结构蛋白中，SigmaC蛋白表现出高度的抗原异质性，作为一种抗原亚型，而非不同的血清型标志，该蛋白位于病毒衣壳表面，能够诱导细胞凋亡，能够增强病毒感染细胞能力，与病毒的致病性密切相关，是引起病毒抗原发生变异的主要原因。由于此蛋白具有高度变异特性，因此可以用其比较不同呼肠孤病毒株之间的序列差异，分析其序列差异与毒株致病力、免疫原性的关系，研究不同毒株之间的抗体交叉保护性。本专利技术利用发现的ARVSigmaC基因的部本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种四联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白；其中肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种四联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白；其中肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1。2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其中鸡新城疫病毒每0.1ml病毒含量≥109.0EID50；鸡传染性支气管炎病毒每0.1ml病毒含量≥106.7EID50、H9亚型禽流感病毒每0.1ml病毒含量应≥109.0EID50；肉鸡呼肠孤病毒SigmaC蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：李陆梅，宫晓，于可超，张青，张玉杰，邹敏，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37