一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法，该疫苗采用同胚接种的方式，选用6日龄鸡胚的卵黄囊接种禽脑脊髓炎病毒，然后将该鸡胚继续孵化至10‑12日龄，在其尿囊腔中接种鸡新城疫病毒，接种后2‑6天，收获病毒，然后将得到的混合病毒与保护剂混合、冻干，制成疫苗。该疫苗降低了生产成本和活疫苗中非有效物质的含量，减少免疫应激，此外该疫苗采用饮水免疫，降低疫苗接种的成本，其所使用的保护剂，可以降低冻干过程中的效价损失，提高饮水免疫过程中的稳定性，保证疫苗免疫效。

Preparation of an inactivated vaccine against Newcastle disease and avian encephalomyelitis

The invention provides a preparation method of live vaccine of Newcastle disease and Avian encephalomyelitis virus. The vaccine adopts the method of homozygous inoculation. The yolk sac of 6-day-old chicken embryo is inoculated with Avian encephalomyelitis virus. Then the chicken embryo is hatched to 10-12 days-old and inoculated with Newcastle disease virus in its allantoic cavity. After 2-6 days of inoculation, the virus is harvested, and the obtained mixed virus is harvested. Mixed with protectant and lyophilized to make vaccine. The vaccine reduces the production cost and the content of non-effective substances in the live vaccine, and reduces the immune stress. In addition, the vaccine uses drinking water immunization to reduce the cost of vaccination. The protective agent used in the vaccine can reduce the loss of titer in the freeze-drying process, improve the stability of the drinking water immunization process, and ensure the immune efficacy of the vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎二联灭活疫苗的制备方法
本专利技术属于兽用生物制药领域，具体是一种禽用二联活疫苗的制备方法。
技术介绍
禽脑脊髓炎(AvianEncephalomyelitis，AE)又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病。种鸡群发病期间及发病前后各1个月内产蛋急剧下降，导致孵化率降低并引起子代雏鸡带毒发病。目前该病在我国流行日趋严重，由于没有特效的根治药物，因此主要依靠疫苗免疫进行预防。鸡新城疫疾病是由副粘病毒引起的高度接触性传染病，俗称“鸡瘟”，本病一年四季均可发生，尤以寒冷和气候多变季节多发。各种日龄的鸡均能感染，死亡率高。主要特征是呼吸困难，神经机能紊乱，粘膜和浆膜出血和坏死。传播速度快，死亡率高，危害严重，给养禽业带来巨大损失，目前也主要依靠疫苗免疫。现有的禽脑脊髓炎主要为灭活疫苗，截止目前我国获批的禽脑脊髓炎活疫苗采用翅下刺种的方式接种，疫苗安全性存在一定隐患，同时灭活疫苗制备成本过高；新城疫虽然有活疫苗，但当二者混合感染时需要分别免疫，增加了免疫成本。有报道将二者分别接种SPF鸡胚扩毒后再混合制备成二联苗，但该方法会在疫苗中引入过多的非有效物质，且该方法制备的新城疫病毒和禽脑脊髓病毒的二联疫苗存在抗原竞争抑制现象，无法获得理想的免疫效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法。本专利技术的目的还在于通过同胚接种，降低疫苗生产成本的同时减少疫苗中非有效物质的含量，进而减少免疫应激。本专利技术的目的还在于采用饮水免疫方法，降低了疫苗的接种成本和人为因素带来的免疫失败的风险，增加疫苗免疫的安全性，减少免疫应激，有利于规模化生产的需要和集约化养殖的需求。为实现以上技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法，其具体步骤为：(1)选用6日龄鸡胚，于其卵黄囊中接种禽脑脊髓炎病毒；(2)接种后，继续孵化培养，弃掉4～6天死亡的鸡胚。(3)将存活鸡胚继续孵化至10-12日龄，于其尿囊腔中接种鸡新城疫病毒；(4)接种新城疫病毒后2-6天，收集病料并制备抗原液；(5)将抗原液与保护剂按处方比例混合、冻干，制成疫苗。进一步的，步骤(1)所述的禽脑脊髓炎病毒的接种浓度为：103.5-104.5EID50/胚。进一步的，步骤(3)所述的鸡新城疫病毒的接种浓度为：105.2-105.5EID50/胚。进一步的，步骤(4)所述的收集病料包括：将2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集,放置于4-8℃冷库冷却，分别收集尿囊液和鸡胚组织，经研磨、混合、冻融、离心后最终收获抗原液。进一步的，步骤(5)所述的保护剂中含有明胶8-12％、蔗糖22-25％、海藻糖5-10％，和山梨醇3-5％。进一步的，步骤(5)所述的保护剂中含有明胶8％，蔗糖22％，海藻糖10％，山梨醇3％。进一步的，步骤(5)所述的疫苗的冻干包括以下步骤：将抗原液与保护剂按照6～8:1的比例混合，充分混匀后分装，冻干。进一步的，步骤(5)所述的疫苗的冻干包括以下步骤：将抗原液与保护剂按照7:1的比例混合，充分混匀后分装，冻干。进一步的，所述二联活疫苗的免疫途径为饮水免疫。采用上述技术方案，本专利技术具有的有益效果为：(1)制备鸡新城疫毒液和禽脑脊髓炎毒液采用同胚接种的方式，降低了生产成本，降低了活疫苗中非有效物质的含量，减少免疫应激。(2)本专利技术所提供的免疫方法采用饮水免疫方法，降低疫苗接种的成本，减少动物免疫过程中造成的应激，提高家禽生产性能。(3)本专利技术涉及到的新型保护剂，降低冻干过程中的效价损失，提高饮水免疫过程中的稳定性，保证疫苗免疫效果。具体实施方式以下具体说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围的前提下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围。实施例1：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法(1)禽脑脊髓炎毒种接种取6日龄SPF鸡胚，将含量为105.5EID50/0.1mL的禽脑脊髓炎毒种进行100倍稀释，采用卵黄接种的方法，每胚接种0.2ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养，弃掉4-6天死亡的鸡胚。(2)鸡新城疫毒种的接种经步骤(1)中的存活的鸡胚，继续孵化至10-12日龄，将含量为108.5EID50/0.1mL的鸡新城疫毒种进行1000倍稀释，采用尿囊腔接种的方法，每胚接种0.1ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养。(3)抗原的收获将新城疫病毒接种后2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集，放置于4-8℃冷库冷却，全部分别收获尿囊液和鸡胚组织，研磨，将鸡胚组织与2倍体积的鸡胚尿囊液充分混合，冻融2次后5000～7000rpm/min离心，取上清即为收获的抗原液。(4)保护剂的配制冻干保护剂中明胶10％，蔗糖25％，海藻糖5％，山梨醇5％，依次分别溶解在纯化水中，0.22um过滤器过滤除菌。(5)疫苗冻干将收获的病毒抗原与保护剂8:1的比例混合，充分混匀后，分装，冻干。实施例2：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法(1)禽脑脊髓炎毒种接种取6日龄SPF鸡胚，将浓度含量为105.5EID50/0.1mL的禽脑脊髓炎毒种进行100倍稀释，采用卵黄接种的方法，每胚接种0.2ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养，弃掉4-6天死亡的鸡胚。(2)鸡新城疫毒种的接种经步骤(1)中的存活的鸡胚，继续孵化至10-12日龄，将浓度含量为108.5EID50/0.1mL的鸡新城疫毒种进行1000倍稀释，采用尿囊腔接种的方法，每胚接种0.1ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养。(3)抗原的收获将新城疫病毒接种后2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集，放置于4-8℃冷库冷却，全部分别收获尿囊液和鸡胚组织，研磨，将鸡胚组织与2倍体积的鸡胚尿囊液充分混合，冻融3次后5000～7000rpm/min离心，取上清即为收获的抗原液。(4)保护剂的配制冻干保护剂中明胶8％，蔗糖22％，海藻糖10％，山梨醇3％，依次分别溶解在纯化水中，0.22um过滤器过滤除菌。(5)疫苗冻干将收获的病毒抗原与保护剂7:1的比例混合，充分混匀后，分装，冻干。实施例3：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法(1)禽脑脊髓炎毒种接种取6日龄SPF鸡胚，将含量为105.5EID50/0.1mL的禽脑脊髓炎毒种进行100倍稀释，采用卵黄接种的方法，每胚接种0.2ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养，弃掉4-6天死亡的鸡胚。(2)鸡新城疫毒种的接种经步骤(1)中的存活的鸡胚，继续孵化至10-12日龄，将含量为108.5EID50/0.1mL的鸡新城疫毒种进行1000倍稀释，采用尿囊腔接种的方法，每胚接种0.1ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养。(3)抗原的收获将新城疫病毒接种后2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集，放置于4-8℃冷库冷却，全部分别收获尿囊液和鸡胚组织，研磨，将鸡胚组织与2倍体积的鸡胚尿囊液充分混合，冻融后5000～7000rpm/min离心，取上清即为收获的抗原液。(4)保护剂的配制冻干保护剂中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的二联疫苗的制备方法包括如下步骤：(1)选用6日龄鸡胚，于其卵黄囊中接种禽脑脊髓炎病毒；(2)接种后，继续孵化培养，弃掉4～6天死亡的鸡胚。(3)将存活鸡胚继续孵化至10‑12日龄，于其尿囊腔中接种鸡新城疫病毒；(4)接种新城疫病毒后2‑6天，收集病料并制备抗原液；(5)将抗原液与保护剂按处方比例混合、冻干，制成疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的二联疫苗的制备方法包括如下步骤：(1)选用6日龄鸡胚，于其卵黄囊中接种禽脑脊髓炎病毒；(2)接种后，继续孵化培养，弃掉4～6天死亡的鸡胚。(3)将存活鸡胚继续孵化至10-12日龄，于其尿囊腔中接种鸡新城疫病毒；(4)接种新城疫病毒后2-6天，收集病料并制备抗原液；(5)将抗原液与保护剂按处方比例混合、冻干，制成疫苗。2.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的禽脑脊髓炎病毒的接种浓度为：103.5～104.5EID50/胚。3.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的鸡新城疫病毒的接种浓度为：105.2～105.5EID50/胚。4.根据权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的收集病料包括：将2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集,放置于4-8℃冷库冷却，分...

【专利技术属性】
技术研发人员：李守军，康亚男，郁宏伟，张小波，张立霞，陈冰，唐荣宏，王艳晓，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12