一种人体尿液中多种有机酸的定量检测方法技术

本发明专利技术涉及生化检测技术领域，具体涉及一种同步定量检测人体尿液中多种有机酸含量的方法。该检测方法首先将人体尿液与内标液混合，然后通过有机溶剂萃取的方式将目标有机酸提取纯化，随后用强阴离子交换柱纯化后采用液相色谱分离与质谱子母离子对检测联用的方法对目标有机酸进行同步定性和定量分析。萃取纯化步骤保证了尿液中目标有机酸的充分溶出，排除尿液中杂质的干扰，确保了检测结果的准确性和稳定性。该方法适用于人体尿液中结构类别多样的有机酸的同步批量检测，具有灵敏度高、精密度高、重复性好、检测速度快等优点。充分满足了临床检验的需要，具有较高的临床应用价值。

A Quantitative Detection Method for Multiple Organic Acids in Human Urine

【技术实现步骤摘要】
一种人体尿液中多种有机酸的定量检测方法
本专利技术涉及生化检测
，尤其涉及一种同步定量检测人体尿液中多种有机酸含量的方法。
技术介绍
有机酸是身体基本代谢过程中产生的一大类化合物。它们来自膳食蛋白质，脂肪和碳水化合物，被身体用于产生细胞能量并提供细胞功能所必需的营养。尿液有机酸测试选择的代谢物，可以作为异常代谢的重要诊断指标。代谢失衡是一种常见且普遍的疾病，可能是许多慢性疾病的基础，例如疲劳，胃肠功能障碍，肌肉/关节问题，情绪障碍和头痛。这些疾病通常对长期治疗和持续改善有抵抗力。有机酸分析传统上可以用于早期检测/排除或监测代谢障碍。尿液样本可用于评估肠道，肝脏和神经系统健康以及能量代谢和营养缺乏。蛋白质、脂肪和碳水化合物，作为人体主要的食物被用于产生细胞能量并提供细胞功能所必需的营养。但食物中同时也应该包括其它必要的营养素，只有在这些必要营养素的帮助下食物才能转化为能量和营养被人体吸收。当食物代谢时，某些必要营养素的缺乏会导致能量生成和营养吸收的通路受阻，同时产生的有机酸代谢产物就会排入尿液中。因此通过尿液中有机酸的测定可以评估个体能量代谢情况和特定的营养素是否缺乏。对于测量的许多有机酸，尿中异常高的水平通常表明特定的代谢通路被阻碍，该代谢通路所必需的营养素水平较低。尿液有机酸测试有助于理解营养素代谢的执行方式，并确定代谢周期可能存在不平衡的地方。举例说明，B族维生素，特别是B1(硫胺素)，B3(烟酸)和B5(泛酸)，为所有体细胞的能量通路提供必需的辅助因子。当食物被代谢时，在需要维生素B参与的步骤中形成特定化合物。这些步骤发生在碳水化合物代谢中，其中形成丙酮酸和乳酸。这些化合物水平升高的说明这个反应的辅助酶活力低，因此需要增加B族维生素，特别是硫胺素和泛酸。在增加这些必需营养素的摄入后，反应的通路重新被打通，细胞的能量产生效率恢复。几乎身体系统的每个环节都需要酶辅助因子，这些辅助因子如维生素或矿物质的缺乏会广泛影响的身体功能，包括免疫，内分泌，肌肉骨骼和代谢系统。对于测量的许多有机酸，尿中异常高的水平通常表明分解该化合物所需的营养素水平较低。在此基础上，功能性评估特定营养素的需求，创建个性化治疗方案是改善患者症状的最佳选择。因此，本研究开发一种尿液中多种有机酸代谢产物的定量检测方法。该方法具有检测灵敏度高、重复性好、检测速度快，检测批量大的优点，能高效的对有机酸代谢产物进行精确的定量检测，具有良好的科研和商业应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱联用串联质谱技术检测人体尿液中多种有机酸代谢产物的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：步骤1、尿液与内标液混合后通过有机溶剂将目标有机酸萃取纯化，氮气吹干后溶于水中，然后用强阴离子交换柱纯化，有机溶剂洗脱后氮气吹干，溶于水中得到待测样本；步骤2、将上述待测样本通过液相色谱与质谱联用检测，得到有机酸的种类和含量。进一步的，上述步骤1中萃取所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚，优选的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。更进一步的，所述的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。进一步的，上述步骤1中强阴离子交换柱的洗脱溶剂为甲醇或丙酮(加2％甲酸)。进一步的，上述步骤2中具体包括以下步骤：步骤A：称取有机酸标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；步骤B:量取上述甲醇定容后的内标液，将其分别加入步骤A得到的标准液中，用超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；步骤C：将步骤B得到的待测标准液和步骤1得到的待测样本通过液质联用检测，得到有机酸代谢产物的种类及含量。进一步的，所述有机酸代谢产物包括乙二酸、辛二酸、乙基丙二酸、乳酸、丙酮酸、β-羟基丁酸、柠檬酸，顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸、α-酮-β-甲基戊酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、羟甲基戊二酸、黄尿酸、β-羟基异戊酸和甲基丙二酸。采用有机溶剂萃取和强阴离子交换柱纯化处理人体尿液中的上述有机酸代谢产物，利用高效液相色谱将20种有机酸代谢产物分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述有机酸代谢产物的含量。进一步的，上述步骤C液质联用检测的液相色谱条件为：色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μL，流动相包括A和B，其中A为水溶液，B为混合溶液，流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：0-1min,A:30-100％,B:70-0％；1.1-5min,A:10-60％,B:90-60％；5.1-9min,A:0-50％,B:100-50％；9.1-11min,A:50-100％,B:50-0％；11.1min,A:30-100％,B:70-0％。更进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为50-150mm×2.1-4.6mm,1.8-5μm。更进一步的，液相色谱条件中，流动相A为1-10mmol/L的乙酸铵水溶液+0.1％-1％甲酸的纯水，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的质量比为9-1:1-9。进一步的，上述液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，负离子MRM扫描，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400℃。进一步的，在电喷雾负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：乙二酸(m/z145.2—83.1)、辛二酸(m/z173.2—111.2)、乙基丙二酸(m/z131.1—87.1)、乳酸(m/z89.1—43.1)、丙酮酸(m/z87.1—43.1)、β-羟基丁酸(m/z103.1—59.1)、柠檬酸(m/z191.1—87.1)、顺式乌头酸(m/z173.1—85.1)、异柠檬酸(m/z191.1—73.1)、α-酮戊二酸(m/z145.1—101.1)、α-酮异戊酸(m/z115.1—115.1)、α-酮异己酸(m/z129.2—129.2)、α-酮-β-甲基戊酸(m/z129.2—129.2)、琥珀酸(m/z117.1—73.0)、富马酸(m/z115.1—71.0)、苹果酸(m/z133.1—115.0)、羟甲基戊二酸(m/z117.1—59.0)、黄尿酸(m/z204.2—160.1)、β-羟基异戊酸(m/z117.1—73.1)和甲基丙二酸(m/z117.1—73.1)。内标：D3-甲基丙二酸(m/z120.1—73.1)、D3-乙基丙二酸(m/z134.1—87.1)、D4-柠檬酸(m/z195.1—87.1)。与已有技术相比，本专利技术的优势在于以下3点。1、本专利技术提供的人体尿液中有机酸代谢产物的检测方法将人体尿液与内标液混合后对混合液依次进行有机溶剂萃取和强阴离子柱纯化后进行液质联用的分析。有机溶剂萃取后通过强阴离子柱纯化可以使目标有机酸代谢产物充分溶出并可以提高检测效率，从而可以真实的反应待测样品中有机酸代谢产物的种类和含量，使得检测结果的准确性、重复性和稳定性大大提高。与其它样本处理方法相比，本检测中杂质干扰大大减小，峰型对称，定量检测结果更加稳定可靠，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人体尿液中多种有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：1)尿液与内标液混合后通过有机溶剂将目标有机酸萃取纯化，氮气吹干后溶于水中，然后用强阴离子交换柱纯化，有机溶剂洗脱后氮气吹干，溶于水中得到待测样本；2)将上述待测样本通过液相色谱和质谱联用检测，同步对多种有机酸进行定性和定量的批量检测。

【技术特征摘要】
1.一种人体尿液中多种有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：1)尿液与内标液混合后通过有机溶剂将目标有机酸萃取纯化，氮气吹干后溶于水中，然后用强阴离子交换柱纯化，有机溶剂洗脱后氮气吹干，溶于水中得到待测样本；2)将上述待测样本通过液相色谱和质谱联用检测，同步对多种有机酸进行定性和定量的批量检测。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤中萃取所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚，优选的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。3.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤中强阴离子交换柱的洗脱溶剂为甲醇或丙酮(加2％甲酸)。4.根据权利要求1-3项任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤具体包括以下步骤：步骤1)称取各种有机酸标准品，用甲醇溶解得到不同浓度的标准液；步骤2)称取内标样品定容为内标液，随后加入步骤1)中的标准液，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；步骤3)将步骤2)中得到的待测标准液和权利要求1中得到的待测样本通过液质联用检测，经过标准曲线计算得到尿液中有机酸的种类和含量。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中液质联用检测的液相色谱条件为：色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μL，流动相A为含1-10mmol/L的乙酸铵水溶液+0.1％-1％甲酸的纯水，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈与甲醇的质量比为9-1:1-9；流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：0-1min,A:30-100％,B:70-0％；1.1-5min,A:10-60％,B:90-60％；5.1-9min,A:0-50％,B:100-50％；9.1-11min,A:50-100％,B:50-0％；11.1min,A:30-100％,B:70-0％。...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬智刚，朱文漓，叶尚宇，
申请(专利权)人：成都益康谱科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51