基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于G‑四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，与传统的黄体酮检测方法相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立；使用核酸适配体为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。本发明专利技术检测黄体酮的方法更简便，更灵敏，选择性且成本效益更高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景。

Detection of progesterone using an aptamer sensor based on G-tetrad DNA zyme signal amplification strategy

【技术实现步骤摘要】
基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法
本专利技术涉及一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器构建及其在黄体酮检测中的应用，属于适配体传感

技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：黄体酮是一类典型的内分泌干扰物质，其在人体或动物体中含量高于或低于某个阈值，均会对动物和人类产生不利影响。此外，当人类或动物摄入高剂量的黄体酮后，通常机体吸收的量很少，其余的则作为废物排放到污水中，并可能对环境造成影响。因此，在适当范围内监测环境或临床样品中黄体酮的浓度至关重要。目前检测黄体酮的方法主要是HPLC、LC/MS、酶联免疫吸附试验和放射免疫分析，但这些方法通常成本高，耗时长，操作步骤繁琐且需要经过专门训练的人员来执行，所以限制了它们的进一步应用。电化学检测方法由于具有低成本，快速，高灵敏性和易于小型化等优点，有望用于进行免贵重仪器分析方法的建立，其得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的生物分析方法之一，涉及生物学检测的各个领域。适配体是指经指数富集的配体系统进化技术体外筛选合成得到的一小段单链寡核昔酸序列，对目标分子具有高度亲和性和特异性的识别能力。与免疫传感器相比，核酸适配体与目标物间的亲合力常常要强于抗原抗体之间的亲合力。2015年，研究人员成功筛选出了黄体酮适体并开发了一种电化学适体传感器用于黄体酮的检测，检测限为2.86nM，与其分析方法相比，其成本更低，稳定性更高，检测策略更简单，成为检测目标物的又一极具优势的新方法。然而，这些适配体传感器大多按1:1的信号：目标物比例输出信号，无法实现更低浓度目标物的高灵敏检测。因此，将信号放大策略运用到适配体传感器中以提高检测的灵敏度，这对于检测低浓度生物分子具有重要意义。杂交链放大技术(HybridizationChainReaction，HCR)是基于两个发夹分子的识别、杂交的连锁反应的一种新技术，是检测特定序列的一种无酶扩增技术。HCR技术是目前构建高灵敏生物传感器常用的扩增方法。此外，酶催化放大技术亦是电化学信号放大技术中运用较成熟的技术之一，DNA模拟酶是指由G-四联体序列与血红素(Hemin)组成的具有过氧化物酶活性的复合物，也被称为G-四联体DNAzyme。相比于HRP，G-四联体DNAzyme具有高的化学稳定性，成本低，简单合成，易于修饰等优点，正作为催化信标引起人们的极大关注，在分析测试中具有广泛的应用。G-四联体DNAzyme可催化H2O2氧化邻苯二胺(OPD)生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(DAP)，其可作为电化学信号指示剂。G-四联体DNAzyme这种独特的催化性能非常有利于基于信号放大策略用于检测黄体酮适配体传感器的构建。因此，利用G-四联体DNAzyme信号放大策略进行电化学传感分析方法的开发具有重大的实际意义。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)用于检测黄体酮的方法，如HPLC、LC/MS、酶联免疫吸附试验和放射免疫分析，这些方法成本高，耗时长，需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，且不易于小型化。(2)目前，用于黄体酮检测的适配体传感策略的研究较少，且黄体酮在生物基质中的检测具有挑战性，因为其浓度在1ng·mL-1(1ng·mL-1＝0.325nM)左右，甚至更低。而大多适配体传感器按1:1的信号：目标物比例输出信号，其灵敏度低，检测范围窄，无法实现低浓度目标物的高灵敏检测。解决上述技术问题的难度：一种基于信号放大策略的高灵敏度、高选择性用于黄体酮检测的适配体传感器的构建。解决上述技术问题的意义：公开一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法。与传统的黄体酮检测方法相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立；使用核酸适配体为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。本专利技术检测黄体酮的方法更简便，更灵敏，选择性且成本效益更高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法。本专利技术的技术方案是：基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，具体包括以下步骤：步骤一：黄体酮适配体、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先离心，分别将其溶于二次水中配成100μM的母液，再用DNA稀释液分别稀释到特定浓度，4℃保存待用；步骤二：玻碳电极的打磨及清洗：用三种不同粒径的Al2O3抛光粉依次在麂皮上将玻碳电极打磨抛光；之后用丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗，自然晾干待用；步骤三：通过电聚沉金的方法在步骤(二)处理好的玻碳电极表面沉积金纳米颗粒；步骤四：将步骤(一)获得的适配体溶液滴加在步骤(三)玻碳电极表面上进行孵育，二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入巯基己醇孵育，用于封闭电极表面剩余的活性位点，二次水轻轻冲洗，自然晾干；步骤五：将步骤(一)获得的cDNA溶液滴加在步骤(四)电极表面上进行孵育，水洗、晾干。继续加上不同浓度的黄体酮目标溶液进行孵育，重复水洗、晾干操作；步骤六：在步骤(五)电极表面上同时加入步骤(一)获得的H1和H2溶液混合孵育，水洗、晾干；继续加Hemin溶液孵育，重复水洗晾干操作；步骤七：电化学检测：步骤(六)获得的修饰电极作为工作电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接，通过示差脉冲伏安法对含有H2O2,OPD的PBS混合液进行扫描，记录电化学响应信号。进一步，步骤一中，黄体酮适配体碱基序列为：5’-SH-TTTTTGCATCACACACCGATACTCACCCGCCTGATTAACATTAGCCCACCGCCCACCCCCGCTGC-3’，cDNA碱基序列为：3’-TTGGTGGCGGGT-5’，H1碱基序列为：3’-GAGTGGGCGGACTAATTGTAATCGTGCTTTGCATTACAATTAGTCCGCTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTCTT-5’，H2碱基序列为：5’-ACGAAACGTAATGTTAATCAGGCGCTCACCCGCCTGATTAACATTAGCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTT-3’；离心条件为10000rpm，4℃条件下离心3min；DNA稀释液为pH7.4、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(包含1mmol/LMgCl2、1mmol/LCaCl2、5mmol/LKCl、0.14mol/LNaCl)；黄体酮适配体、cDNA、H1和H2浓度均为10μmol/L；对黄体酮适配体、cDNA、H1和H2浓度的控制，保证电化学响应信号峰值且无浪费。进一步，步骤二中，依次用1μm、0.3μm、0.05μm不同粒径的Al2O3抛光粉打磨玻碳电极，分别顺时针磨50次，逆时针磨50次，丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗时间为1min。对工作电极进行打磨及清洗，避免金属电极表面有一层氧化膜以及防止使用过的电极表面有残余，影响测定。进一步，步骤三中，电极表面电聚沉金：将步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于G‑四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：黄体酮适配体、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先离心，分别将其溶于二次水中配成100μM的母液，再用DNA稀释液分别稀释，4℃保存待用；步骤二：玻碳电极的打磨及清洗：用三种不同粒径的Al2O3抛光粉依次在麂皮上将玻碳电极打磨抛光；之后用丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗，自然晾干待用；步骤三：通过电聚沉金的方法在步骤二处理好的玻碳电极表面沉积金纳米颗粒；步骤四：将步骤一获得的适配体溶液滴加在步骤三玻碳电极表面上进行孵育，二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入巯基己醇孵育，用于封闭电极表面剩余的活性位点，二次水轻轻冲洗，自然晾干；步骤五：将步骤一获得的cDNA溶液滴加在步骤四电极表面上进行孵育，水洗、晾干；继续加上不同浓度的黄体酮目标溶液进行孵育，重复水洗、晾干操作；步骤六：在步骤五电极表面上同时加入步骤一获得的H1和H2溶液混合孵育，水洗、晾干；继续加Hemin溶液孵育，重复水洗晾干操作；步骤七：电化学检测：步骤六获得的修饰电极作为工作电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接，通过示差脉冲伏安法对含有H2O2,OPD的PBS混合液进行扫描，记录电化学响应信号。...

【技术特征摘要】
1.一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：黄体酮适配体、cDNA、H1和H2首次开盖使用前先离心，分别将其溶于二次水中配成100μM的母液，再用DNA稀释液分别稀释，4℃保存待用；步骤二：玻碳电极的打磨及清洗：用三种不同粒径的Al2O3抛光粉依次在麂皮上将玻碳电极打磨抛光；之后用丙酮、无水乙醇、二次水依次超声清洗，自然晾干待用；步骤三：通过电聚沉金的方法在步骤二处理好的玻碳电极表面沉积金纳米颗粒；步骤四：将步骤一获得的适配体溶液滴加在步骤三玻碳电极表面上进行孵育，二次水轻轻冲洗，自然晾干；然后加入巯基己醇孵育，用于封闭电极表面剩余的活性位点，二次水轻轻冲洗，自然晾干；步骤五：将步骤一获得的cDNA溶液滴加在步骤四电极表面上进行孵育，水洗、晾干；继续加上不同浓度的黄体酮目标溶液进行孵育，重复水洗、晾干操作；步骤六：在步骤五电极表面上同时加入步骤一获得的H1和H2溶液混合孵育，水洗、晾干；继续加Hemin溶液孵育，重复水洗晾干操作；步骤七：电化学检测：步骤六获得的修饰电极作为工作电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂电极，将三电极与电化学工作站相连接，通过示差脉冲伏安法对含有H2O2,OPD的PBS混合液进行扫描，记录电化学响应信号。2.根据权利要求1所述的一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，其特征在于，步骤一中，黄体酮适配体碱基序列为：5’-SH-TTTTTGCATCACACACCGATACTCACCCGCCTGATTAACATTAGCCCACCGCCCACCCCCGCTGC-3’，cDNA碱基序列为：3’-TTGGTGGCGGGT-5’，H1碱基序列为：3’-GAGTGGGCGGACTAATTGTAATCGTGCTTTGCATTACAATTAGTCCGCTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTCTT-5’，H2碱基序列为：5’-ACGAAACGTAATGTTAATCAGGCGCTCACCCGCCTGATTAACATTAGCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTT-3’；离心条件为10000rpm，4℃条件下离心3min；DNA稀释液为pH7....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰倩，石维平，蔡杰，杨娅妮，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52