一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，以钩藤根、茎徒手切片进行生物碱染色，根据染色结果剥离各着色部位并测定其总生物碱，明确生物碱储存结构部位和含量，以此鉴别钩藤药材并确定药材的综合开发利用策略。传统方法采收钩藤药材时，其根、茎、叶均未被利用，造成资源极大浪费。本发明专利技术以钩藤根、茎为材料，进行生物碱染色观察及总生物碱提取，从而确定生物碱在钩藤中的积累部位及含量，并作为判定钩藤药材质量的有效方法，旨在改进其药材的传统利用方式，将根、茎、叶加以综合利用，以实现其经济效益的最大化。

A Method for Alkaloids Detection of Uncaria Uncaria Based on Histochemical Location and Chemical Composition Analysis

【技术实现步骤摘要】
一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法
本专利技术涉及植物组织切片、生物碱染色及含量测定技术，具体涉及钩藤徒手切片、生物碱染色和总生物碱含量测定方法。
技术介绍
钩藤[Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.exHavil.]为茜草科(Rubiaceae)钩藤属(UncariaSchrebernom.cons.)多年生木质藤本植物，以干燥带钩茎枝入药。其味甘，性凉，归肝、心包经；有息风定惊、清热平肝等功效；用于肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫及头痛眩晕等症。钩藤中主要药效成分为吲哚类生物碱，包括钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、柯诺辛碱、柯南因碱等百余种，其中以钩藤碱和异钩藤碱含量较高。在钩藤采集、收购过程中，药商为避免钩藤药材掺假，而仅收购带钩枝条，其余部分被丢弃，由于钩藤根、茎及叶虽不长钩，但生物碱含量较高，被丢弃造成资源的极大浪费。由于现有的收购过程中无法检测钩藤根、茎及叶的生物碱含量，药商为避免钩藤药材掺假，而仅收购带钩枝条，其余部分被丢弃，从而造成资源的极大浪费。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法。该专利技术为钩藤药材鉴别及药材资源的综合开发利用开辟了新途径，能避免钩藤药材掺假，同时减少钩藤资源的浪费等优点。本专利技术的技术方案：一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，包括以下步骤：a、以钩藤根、钩藤茎为材料，蒸馏水洗净后通过徒手切片，选择大小均匀、厚度为0.1～0.5mm的薄片置于载玻片上，分别用改良碘化铋钾染色剂、溴甲酚绿试剂及浓硝酸对钩藤根、钩藤茎切片进行染色；b、另取钩藤根、钩藤茎洗净后，根据步骤1中生物碱染色结果，将钩藤根、钩藤茎中着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为35～75℃，烘干时间为3～8天，取出后磨粉过筛，收集备用；c、取步骤2中钩藤粉末0.5～2.0g置于锥形瓶中，加入2～10ml氨溶液润湿10～90min，再加入甲醇，料液比为1:30～1:70g/mL，超声提取20～60min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，萃取剂萃取三次，每次4～8mL，定容至25mL，在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准溶液，做出标准曲线，最后计算出钩藤样品中总生物碱含量。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述步骤a中每个试剂的染色处理时间均为15min，染色结束，试剂均吸干后滴加蒸馏水清洗，盖上盖玻片，置于显微镜下观察生物碱积累部位，以此作为下一步组织结构剥离的依据。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述步骤b中根据钩藤根、钩藤茎染色结果将着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为55℃，烘干5天，磨粉过40目筛。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述步骤c中，称取1g钩藤粉末于锥形瓶中，加入5ml氨溶液润湿30min，再加入甲醇，料液比为1:50g/mL，超声提取40min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，萃取剂萃取三次，每次4mL，定容至25mL，并在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准曲线，最后计算出钩藤样品中总生物碱含量。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，步骤c中所述的pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL由0.2mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液25ml与0.1mol/L盐酸6ml混合，加蒸馏水稀释至100ml制得，PH为3.6。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，步骤c中所述的萃取剂为三氯甲烷。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述改良碘化铋钾为0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸和40mL蒸馏水中，再与20mL40％的碘化钾混合。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述氨溶液由氨水、蒸馏水、无水乙醇按体积比9:30:16的比例配制而得。前述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，所述溴甲酚绿试剂由0.1g溴甲酚绿溶于2.8ml，0.05mol/LNaOH溶液中，蒸馏水定容至200ml制得。本专利技术的有益效果：与现有技术相比，本专利技术的技术具有以下优点：传统方法采收钩藤药材时，其钩藤根、钩藤茎、钩藤叶均未被利用，造成资源极大浪费。本专利技术以钩藤根、钩藤茎为材料，进行生物碱染色观察及总生物碱提取，从而确定生物碱在钩藤中的积累部位及含量，并作为判定钩藤药材质量的有效方法，旨在改进其药材的传统利用方式，将根、茎、叶加以综合利用，以实现其经济效益的最大化。附图说明图1为钩藤根、钩藤根茎各结构中生物碱含量图；图2为钩藤中生物碱积累部位图；图3为钩藤材料结构剥离图。附图中的标记：1-根部改良碘化铋钾染色切片×100，2-根部溴甲酚绿染色切片×100，3-根部浓硝酸处理切片×100，4-茎部改良碘化铋钾染色切片×100，5-茎部溴甲酚绿染色切片×100，6-茎部浓硝酸处理切片×100；A-生物碱沉淀，A1-根木质部,B1-根韧皮部,C1-茎髓部,D1-茎木质部,E1-茎韧皮部。具体实施方式本专利技术的实施例1下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不作为对本专利技术限制的依据。一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，构成如图1-3所示，包括以下步骤：a、将钩藤根、钩藤茎为材料，蒸馏水洗净后通过徒手切片，选择大小均匀、厚度为0.2～0.3mm的薄片置于载玻片上，分别用改良碘化铋钾染色剂、溴甲酚绿试剂及浓硝酸对钩藤根、钩藤茎切片薄片进行染色，每个试剂的染色处理时间均为15min；b、另取钩藤根、钩藤茎洗净后，根据步骤1中生物碱染色结果，将钩藤根、钩藤茎中着色结构与未着色结构剥离，置于恒温箱中，烘干温度为55℃，烘干时间为5天，取出后磨粉过筛，收集备用；c、取步骤2中钩藤粉末1g置于锥形瓶中，加入5ml氨溶液润湿30min，再加入甲醇，料液比1:50g/mL，超声提取40min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，三氯甲烷萃取三次，每次4mL，定容至25mL，并在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准溶液，根据标准曲线计算出钩藤样品中总生物碱含量。试验结果如图1中所示，根韧皮部及茎韧皮部中总生物碱含量分别为1.80m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a、以钩藤根、钩藤茎为材料，蒸馏水洗净后通过徒手切片，选择大小均匀、厚度为0.1～0.5mm的薄片置于载玻片上，分别用改良碘化铋钾染色剂、溴甲酚绿试剂及浓硝酸对钩藤根、钩藤茎切片进行染色；b、另取钩藤根、钩藤茎洗净后，根据步骤1中生物碱染色结果，将钩藤根、钩藤茎中着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为35～75℃，烘干时间为3～8天，取出后磨粉过筛，收集备用；c、取步骤2中钩藤粉末0.5～2.0g置于锥形瓶中，加入2～10ml氨溶液润湿10～90min，再加入甲醇，料液比为1:30～1:70g/mL，超声提取20～60min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾‑盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾‑盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，萃取剂萃取三次，每次4～8mL，定容至25mL，在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准溶液，做出标准曲线，最后计算出钩藤样品中总生物碱含量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a、以钩藤根、钩藤茎为材料，蒸馏水洗净后通过徒手切片，选择大小均匀、厚度为0.1～0.5mm的薄片置于载玻片上，分别用改良碘化铋钾染色剂、溴甲酚绿试剂及浓硝酸对钩藤根、钩藤茎切片进行染色；b、另取钩藤根、钩藤茎洗净后，根据步骤1中生物碱染色结果，将钩藤根、钩藤茎中着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为35～75℃，烘干时间为3～8天，取出后磨粉过筛，收集备用；c、取步骤2中钩藤粉末0.5～2.0g置于锥形瓶中，加入2～10ml氨溶液润湿10～90min，再加入甲醇，料液比为1:30～1:70g/mL，超声提取20～60min，过滤后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液30mL，摇匀、过滤，缓冲剂定容到50mL即为供试液；取供试液4mL，酸性染料比色法的显色条件为pH3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液10mL，溴甲酚绿染液10mL，萃取剂萃取三次，每次4～8mL，定容至25mL，在紫外分光光度计413nm波长下取样测定总生物碱OD值，以钩藤碱为对照品制作标准溶液，做出标准曲线，最后计算出钩藤样品中总生物碱含量。2.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述步骤a中每个试剂的染色处理时间均为15min，染色结束，试剂均吸干后滴加蒸馏水清洗，盖上盖玻片，置于显微镜下观察生物碱积累部位，以此为下一步组织结构剥离的依据。3.根据权利要求1所述的一种基于组织化学定位与化学成分分析的钩藤生物碱检测方法，其特征在于：所述步骤b中根据钩藤根、钩藤茎染色结果将着色结构与未着色结构剥离后均置于恒温箱中，烘干温度为55℃，烘干5天，磨粉过40目筛。4.根据权利要求1所述的一种基于组织化...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明生，阙云飞，王晓红，李雪，张智仙，贾娜，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52