多色荧光染料和荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法技术

本发明专利技术揭示了一种适用于多色荧光染料以及荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法，包括：将荧光标记的生物组织样本进行预处理；依次放入不同浓度TB的树脂溶液中梯度渗透，每个浓度1h‑2h,之后作用浓度TB的树脂溶液中渗透12‑24h；用树脂渗透液对上述所述的经梯度处理的样本进行包埋、加热聚合后，得到包埋的荧光标记样本。本发明专利技术以TB作为背景抑制剂，可以抑制背景光，且可以兼容多色荧光染料和荧光蛋白的使用。本发明专利技术所提供的包埋方法，适用于多种树脂包埋，同时适用于多种荧光染料以及荧光蛋白标记的样本。

Plastic Embedding Method for Polychromatic Fluorescent Dyes and Fluorescent Protein Labeled Samples

【技术实现步骤摘要】
多色荧光染料和荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法
本专利技术涉及生物医学工程
，具体涉及一种多色荧光染料标记样本塑性包埋方法。
技术介绍
目前，通过荧光蛋白以及荧光染料标记技术，可以同时获取荧光蛋白以及荧光染料标记信息，对深入研究生物组织的结构和功能与疾病等关系有着重要的作用。现有的包埋方法，采用纯树脂或者溶解了SBB和DTT的树脂样本渗透包埋荧光生物组织，可包埋多种颜色荧光蛋白标记的生物组织，例如绿色/红色/蓝色荧光蛋白标记的组织，它的不足之处在于：这种包埋方法不适于各种荧光染料标记生物样本，从而大大限制了其应用，例如采用SBB作为背景抑制剂，但SBB在红色及红外波段有自发荧光，限制了其在多色特别是红色荧光蛋白以及多种荧光染料样本中的使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种适用于多种荧光染料和荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法。为解决以上技术问题，本专利技术的技术方法包括：将生物组织样本进行预处理；将预处理后的生物组织样本依次放入0。5-95wt%的梯度浓度酒精中进行渗透，每个梯度0。5-3小时，随后分别在含0。7-1wt/%TB不同质量浓度的梯度树脂中渗透6-24小时；用树脂渗透液对所述经梯度浓度渗透后的样本进行包埋、加热聚合后得到包埋的荧光染料标记样本。优选的，所述对生物样本进行预处理包括：将生物样本在多聚甲醛固定液中固定12-24小时；将固定后的生物样本在漂洗液中漂洗6-12小时；将所述漂洗后的生物样本依次放入冰水预冷却的50%、70%乙醇溶液中进行梯度脱水，再在95%或100%乙醇溶液中进行脱水，每次5分钟到2小时。优选的，所述不同质量浓度的梯度树脂的质量浓度为第一梯度40%~60%、第二梯度60%~70%、第三梯度70~90%和第四梯度90%~100%。优选的，所述不同浓度的树脂溶液的质量浓度分别为第一梯度50%、第二梯度70%、第三梯度85%和第四梯度100%。优选的，所述梯度浓度酒精溶液的质量浓度分别为50%、70%、85%和100%。优选的，所述用树脂渗透液对所述经梯度渗透后的生物样本进行包埋具体为：将梯度渗透后的生物样本放置于包埋模具中，随后在模具中充满包埋树脂液。优选的，所述树脂渗透液和包埋树脂溶液中的树脂具体为GMA树脂。优选的，加热后得到包埋的荧光染料标记样本具体为：将所述填充后的模具在35℃-40℃下加热12到24小时。优选的，所述树脂溶液的溶剂为95%乙醇。优选的，所述生物样本选自荧光探针标记的生物样本。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术方法使用含TB的树脂进行渗透和较低的聚合温度进行包埋聚合，能够完全的保护原有的荧光信号；同时使用含TB的树脂梯度渗透可显著的降低红色通道的背景光；能够保存生物组织的抗原活性；适用于多种尺寸的生物样本；所得到的包埋的生物组织可以结合连续超薄切片和块面成像技术，快速同时获取全脑荧光染料标记样本和荧光蛋白标记样本的高分辨三维分布，从而进行相关结构和功能的解析。附图说明下面结合附图对本专利技术技术方案作进一步说明：图1为传统的树脂包埋方法制备的脑组织红色荧光染料（Dylight594）标记血管成像结果；图2为本专利技术实施例1包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织红色荧染料（Dylight594）标记血管成像结果；图3为本专利技术实施例1包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织红色荧光染料（Dylight488）标记血管成像结果；图4为本专利技术实施例2包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织红色染料（DANIR-8C）标记amyloid-β成像结果；图5为本专利技术实施例3包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织红色荧光蛋白（tdTomato）成像结果；图6为本专利技术实施例3包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织绿色荧光蛋白（GFP）成像结果；图7为本专利技术实施例3包埋的高信噪比的树脂包埋方法制备的脑组织蓝色荧光蛋白（BFP）成像结果。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。名词解释GMA树脂：甲基丙烯酸缩水甘油酯。TB:美国biotium公司生产的trueblack树脂。本专利技术提供了一种多色荧光染料以及荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法，包括：将生物组织样本进行预处理；将预处理后的生物组织样本依次放入0。5-95wt%的梯度浓度酒精中进行渗透，每个梯度0。5-3小时，随后分别在含0。7-1wt/%TB不同质量浓度的梯度树脂中渗透6-24小时；用树脂渗透液对所述经梯度浓度渗透后的样本进行包埋、加热聚合后得到包埋的荧光染料标记样本。优选的所述不同质量浓度的梯度树脂的质量浓度为第一梯度40%~60%、第二梯度60%~70%、第三梯度70~90%和第四梯度90%~100%。更优选的所述不同浓度的树脂溶液的质量浓度分别为第一梯度50%、第二梯度70%、第三梯度85%和第四梯度100%。所述梯度浓度酒精溶液的质量浓度分别为50%、70%、85%和100%。按照本专利技术，加热后得到包埋的荧光染料标记样本具体为：将所述填充后的模具在35℃-40℃下加热12到24小时。按照本专利技术，所述树脂溶液的溶剂为95%乙醇。为了更好的得到包埋的生物样本，首先对生物样本进行预处理，具体为：将生物样本在多聚甲醛固定液中固定12-24小时；将固定后的生物样本在漂洗液中漂洗6-12小时；将所述漂洗后的生物样本依次放入冰水预冷却的50%、70%乙醇溶液中进行梯度脱水，再在95%或100%乙醇溶液中进行脱水，每次5分钟到2小时。所述用树脂渗透液对所述经梯度渗透后的生物样本进行包埋具体为：将梯度渗透后的生物样本放置于包埋模具中，随后在模具中充满包埋树脂液。所述树脂渗透液和包埋树脂溶液中的树脂具体为GMA树脂。本专利技术中所有使用的所述生物样本选自荧光探针标记的生物样本。下面通过具体的实施实例对本专利技术的技术发案作进一步的描述。实施例1对成年的C57小鼠，采用尾静脉注射DyLight594,20分钟后使用1%戊巴比妥钠麻醉，采用心脏灌注方式进行灌注以及固定。先采用预热的0。01M磷酸盐缓冲液溶液灌注5-7min,之后采用预冷的4%多聚甲醛和2。5%蔗糖混合固定液灌注7-10分钟。灌注结束后，快速将小鼠脑组织取出并放入4%预冷的多聚甲醛和2。5%蔗糖混合固定液中，4℃环境中后固定6-24小时。后固定好的脑组织采用4℃预冷的0。01M磷酸盐缓冲液溶液进行漂洗12-24小时，中间更换新鲜的溶液3-5次，以便彻底去除脑组织中残余的固定液。漂洗结束后，将脑组织放入预冷的50%、70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每个梯度1-2h。脱水结束后，将脑组织放入预冷含有0。5-1%TB的50%、70%、85%和100%的GMA树脂中进行梯度渗透，每个梯度2-3小时,其中50%、70%、85%GMA树脂渗透液的溶剂为95%乙醇；随后将梯度渗透后的脑组织放入含0。5%-1%TB的100%GMA树脂中渗透48-72h，中间更换新鲜的100%GMA树脂2次。其中，上述所述的100%GMA树脂由52。3%GMA单体、3%水、44。1%甲基丙烯酸丁酯和0。6%偶氮二异庚腈配制而成。将渗透结束的脑组织放入聚合模具中，在模具中加满含有0。5%-1%TB的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多色荧光染料以及荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法，其特征在于，包括：将生物组织样本进行预处理；将预处理后的生物组织样本依次放入0；5‑95wt%的梯度浓度酒精中进行渗透，每个梯度0；5‑3小时，随后分别在含0；7‑1wt/%TB不同质量浓度的梯度树脂中渗透6‑24小时；用树脂渗透液对所述经梯度浓度渗透后的样本进行包埋、加热聚合后得到包埋的荧光染料标记样本。

【技术特征摘要】
1.一种多色荧光染料以及荧光蛋白标记样本的塑性包埋方法，其特征在于，包括：将生物组织样本进行预处理；将预处理后的生物组织样本依次放入0；5-95wt%的梯度浓度酒精中进行渗透，每个梯度0；5-3小时，随后分别在含0；7-1wt/%TB不同质量浓度的梯度树脂中渗透6-24小时；用树脂渗透液对所述经梯度浓度渗透后的样本进行包埋、加热聚合后得到包埋的荧光染料标记样本。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对生物组织样本进行预处理包括：将生物组织样本在多聚甲醛固定液中固定12-24小时；将固定后的生物组织样本在漂洗液中漂洗6-12小时；将所述漂洗后的生物组织样本依次放入冰水预冷却的50%、70%乙醇溶液中进行梯度脱水，再在95%或100%乙醇溶液中进行脱水，每次5分钟到2小时。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同质量浓度的梯度树脂的质量浓度为第一梯度40%~60%、第二梯度60%~70%、第三梯度70~90%和第四梯度90%~100...

【专利技术属性】
技术研发人员：李向宁，龚辉，田娇娇，任淼，
申请(专利权)人：华中科技大学苏州脑空间信息研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32