一种胆固醇酯酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胆固醇酯酶的制备方法，属于酶工程技术领域。本发明专利技术中的胆固醇酯酶是利用保藏编号为CCTCC NO:M2017661的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ZWS15进行制备得到。该酶具有良好的酸碱稳定性和温度稳定性，70℃下2小时酶活残留量还有70％，且能够耐受5％的高浓度的表面活性剂，和50％高浓度的有机溶剂。本发明专利技术制备得到的胆固醇酯酶对胆固醇苯甲酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯、胆固醇辛酸酯的胆固醇酯酶活力分别高达415U/L、1038U/L、996U/L、294U/L。且能够降解三酰基甘油酯及对硝基苯酯类底物。

A preparation method of cholesterol esterase

【技术实现步骤摘要】
一种胆固醇酯酶的制备方法
本专利技术涉及一种胆固醇酯酶的制备方法，属于酶工程

技术介绍
胆固醇酯酶(EC3.1.1.13)，主要作用于水溶性介质中的胆固醇酯，使其水解为胆固醇和脂肪酸。其广泛存在于哺乳动物组织和微生物体中，相较于哺乳动物来源酶的产量低、纯化复杂、性质不理想等缺陷，微生物来源的胆固醇酯酶生产成本低，较动物来源胆固醇酯酶具有更广泛的作用pH与作用温度，显示出更高的稳定性和底物特异性，因此逐渐成为研究热点。胆固醇酯酶因其与人体脂质代谢及胆固醇吸收有关，通常作为检测用酶用于检测血液中总胆固醇含量；另外胆固醇酯酶在食品、污水处理、制浆造纸工业、皮革织物脱脂等领域也有广阔的应用前景。在后几种场合应用到的酶在大多数情况下需要宽泛的底物特异性、较高的温度耐受性和有机溶剂耐受性，如制浆造纸工业中处理温度一般为60℃～80℃。胆固醇酯酶是酯酶的一种，属于α/β水解酶家族中的酯类水解酶(EC3.1.1.X)，该类酶中还包括了脂肪酶(EC3.1.1.3)。胆固醇酯酶和脂肪酶最大的区别在其水解底物种类不同，脂肪酶主要作用于长链脂肪酸形成的酯键，胆固醇酯酶主要作用于短链脂肪酸形成的酯键，而少部分胆固醇酯酶也可以水解脂肪酶的底物。Smirnov等人在1980年提出胆固醇酯酶可以分为两大类，一类特异性水解胆固醇酯类物质，如荧光假单胞来源的胆固醇酯酶对长链胆固醇酯具有显著偏好性，来源于洋葱伯克霍尔德菌ST-200的胆固醇酯酶对芳香脂类底物具有高度特异性；另一类在降解胆固醇酯类底物的同时具有解脂能力(即可以水解脂肪酶的底物)，如链霉菌X9来源的胆固醇酯酶也可以降解三油酸甘油酯，来源于Ophiostomapiceae的还可以有效的降解三丁酸甘油酯。除水解底物种类宽泛外，研究表明部分胆固醇酯酶对有机溶剂和表面活性剂也具有显著耐受性。Takeda等从洋葱伯克霍尔德菌ST-200中获得胆固醇酯酶，其具有较好的温度耐受性(4℃～65℃)，在20％甲醇存在下，酶活能够提高到7.2倍；Sintawee等发现来自铜绿假单胞菌的胆固醇酯酶在37℃下放置28天后仍能残留70％的酶活；Hanna从Melanocarpusalbomyces中纯化出一种胆固醇酯酶，在5％曲拉通X-100的存在下。但是，目前大部分研究仅侧重于胆固醇酯酶对亲水性有机溶剂的耐受性，而对胆固醇酯酶对疏水性有机溶剂的耐受性现有报导，且耐受的有机溶剂浓度较低，耐受的温度仍然不足以满足工业上的需求。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种耐高温、耐有机溶剂的胆固醇酯酶的制备方法，利用本专利技术的方法制备得到的胆固醇酯酶，具有水解底物种类多，对高温、亲水性和疏水性有机溶剂和表面活性剂耐受性能好，适用于食品、污水处理、制浆造纸工业、织物脱脂等领域中，为其进一步工业化应用提供参考与借鉴。本专利技术的第一个目的是提供一种耐高温、耐有机溶剂的胆固醇酯酶的制备方法，是利用保藏编号为CCTCCNO:M2017661的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)ZWS15进行制备生产。在本专利技术的一种实施方式中，所述制备是使用胆固醇酯类作为诱导物，在含有曲拉通X-100的发酵培养基中诱导洋葱伯克霍尔德菌ZWS15进行发酵生产。在本专利技术的一种实施方式中，所述胆固醇酯类为：胆固醇苯甲酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯或胆固醇辛酸酯。在本专利技术的一种实施方式中，所述曲拉通X-100的浓度为0.34％(v/v)。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵温度为25～30℃。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的配方为：每1L蒸馏水中添加蛋白胨10g，酵母粉5g，K2HPO42g，KCl0.5g，NaNO32g，TritonX-1003.4mL，MgSO4100mM，葡萄糖0.1g，胆固醇油酸酯2g，pH7.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还包括：将利用洋葱伯克霍尔德菌ZWS15进行发酵生产得到的发酵液，使用硫酸铵沉淀，将沉淀溶解后用DEAE离子交换柱进行纯化，得到胆固醇酯酶。本专利技术的第二个目的是提供一种检测血清总胆固醇的试剂盒或者污水处理剂，含有权利要求1制备得到的胆固醇酯酶。本专利技术的第三个目的是提供一种制备检测血清总胆固醇的试剂盒、制备污水处理剂、制浆造纸或者皮革织物脱脂的方法，利用所述方法制备胆固醇酯酶，然后以得到的胆固醇酯酶制备检测血清总胆固醇的试剂盒或者污水处理剂。本专利技术的第四个目的是提供一种降解三酰基甘油酯类和对硝基苯酯类的方法，利用所述的方法制备胆固醇酯酶，以得到的胆固醇酯酶进行降解。在本专利技术的一种实施方式中，所述三酰基甘油酯类为橄榄油、三油酸甘油酯或三丁酸甘油酯；所述对硝基苯酯类为对硝基苯棕榈酸酯或对硝基苯乙酸酯。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的到的胆固醇酯酶在pH5.5～9.0下，相对酶活可以达到85％以上；70℃下2小时酶活残留量还有70％，具有良好的酸碱稳定性和温度稳定性。(2)本专利技术的到的胆固醇酯酶能够耐受5％的高浓度的表面活性剂，在5％曲拉通X-100中相对酶活达到1.2倍；对有机溶剂具有很强耐受性，在50％高浓度有机溶剂的环境中，该酶的酶解能力仍没有明显削弱，50％高浓度乙醇和环己烷存在下，相对酶活能达到1.25和1.21倍。(3)本专利技术的到的胆固醇酯酶对不同的胆固醇酯：胆固醇苯甲酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯、胆固醇辛酸酯的胆固醇酯酶活力分别高达415U/L、1038U/L、996U/L、294U/L。(4)本专利技术的到的胆固醇酯酶具有较强的解脂能力，能够降解三酰基甘油酯(橄榄油、三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯)及对硝基苯酯类(对硝基苯棕榈酸酯、对硝基苯乙酸酯)底物，解酯活力分别高达933U/L、467U/L、267U/L、203165U/L、160U/L。生物材料本专利技术所提供的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)ZWS15，分类学命名为BurkholderiacepaciaZWS15洋葱伯克霍尔德菌ZWS15，已于2017年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017661，保藏地址为中国武汉武汉大学。附图说明图1：7.5L罐中洋葱伯克霍尔德菌ZWS15产胆固醇酯酶结果图；图2：纯化后胆固醇酯酶的SDS-PAGE图；M：marker；1：发酵粗酶液；2：70％硫酸铵沉淀后的酶样；3：透析24小时后的酶样；4：DEAE纯化后的酶样。图3：SDS-PAGE中目的条带飞行时间质谱结果；横坐标：离子的质荷比(表示切割肽段的分子大小)；纵坐标：质谱的离子流强度(代表该肽段在总样品中的含量)。图4：胆固醇酯酶最适pH。图5：胆固醇酯酶的pH稳定性。图6：胆固醇酯酶最适温度。图7：胆固醇酯酶温度稳定性。具体实施方式(1)胆固醇酯酶酶活胆固醇酯酶酶活的定义：在一定的温度和pH条件下1min水解胆固醇酯产生1μmol游离胆固醇的酶量。本专利技术中用于测定胆固醇酯酶酶活的底物为：胆固醇酯(包括胆固醇苯甲酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯、胆固醇辛酸酯等)。反应液A：0.2mol/L磷酸钾缓冲液1.5mL，0.6mmol/L胆固醇酯(具体为胆固醇苯甲酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯、胆固醇辛酸酯等)1mL，0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐高温、耐有机溶剂的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，是利用保藏编号为CCTCC NO:M2017661的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ZWS15进行制备生产。

【技术特征摘要】
1.一种耐高温、耐有机溶剂的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，是利用保藏编号为CCTCCNO:M2017661的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)ZWS15进行制备生产。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备是使用胆固醇酯类作为诱导物，在含有曲拉通X-100的发酵培养基中诱导洋葱伯克霍尔德菌ZWS15进行发酵生产。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胆固醇酯类为：胆固醇苯甲酸酯、胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯或胆固醇辛酸酯。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述曲拉通X-100的浓度为0.30～0.40％(v/v)。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为25～30℃。6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玲，杨海麟，孙柳青，辛瑜，王武，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32