一种壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于中药制剂技术领域，具体涉及一种壁虎‑蝉拟青霉双向固体发酵物，并进一步公开其制备方法，以及用于制备治疗肝癌药物中应用。本发明专利技术所述壁虎‑蝉拟青霉双向固体发酵物，在现有壁虎药材的基础上，以蝉拟青霉菌液进行进一步发酵所得，利用壁虎及蝉拟青霉所特有的药性及功能成分，通过二者的深层次相互作用提升壁虎药材的抗肿瘤功能。本发明专利技术所述壁虎‑蝉拟青霉双向固体发酵物通过加水提取的方式获得其有效成分，该水提物对HepG2肝癌细胞有显著的抑制作用，其抑制率范围在60‑80％，相比于相同浓度的壁虎水提物的抗HepG2肝癌细胞活性大幅提高，可用于制备治疗肝癌的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物及其制备方法与应用
本专利技术属于中药制剂
，具体涉及一种壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，并进一步公开其制备方法，以及用于制备治疗肝癌药物中应用。
技术介绍
动物药是中药的重要组成部分，在中医学典籍《黄帝内经》中共有13首方剂，其中有5个处方即是以人体或动物器官及组织入药的；而且在后世的历代方书和本草中，亦有相当数量的关于动物药材的记述，如明代李时珍编著的《本草纲目》共收载药物1892种，其中便有444种为动物药，约占总数的1/4。壁虎作为动物药的一种，其主要活性成分为蛋白质多肽类，大量临床报道已经证实，壁虎入药可以治疗多种恶性肿瘤，包括肝癌、食道癌、胃癌、肺癌、肠道癌肿等，并且尤其对消化道肿瘤的治疗效果显著。但是，在中医药的临床应用中，壁虎多以原虫、原粉或超细粉入药，往往存在着因制剂量大而无法制备高效制剂的缺陷。蝉花是一种外形具有“动物”和“植物”形态特征的奇妙生物，其根是蝉的幼虫体，花则是从单个或是2-3个蝉幼虫头部生长出来的，蝉花从顶端分枝开花，花粉为乳黄色，称为“蝉花孢子粉”，也就是"种子"，具有繁殖的功能。蝉花的形成过程是蝉的幼虫在蝉羽化前被诸如蝉拟青霉等虫草菌感染、寄生，当气候环境适宜时，吸收虫体的营养转化成菌丝体，最终虫体会被菌丝体完全占据而只剩下一个躯壳。当万物复苏时节，菌丝体会从营养阶段逐渐转化为有性阶段，而具有繁殖功能的“蝉花孢子粉”，则会渐从顶端分枝“发芽”，其形似花朵，故而称为蝉花。药理研究表明，蝉花具有免疫调节、抗氧化和抗肿瘤活性，在临床、农业等领域被应用广泛。本专利技术方案以壁虎和蝉拟青霉进行双向固体发酵，以期开发出具有良好功效的药物，进一步扩宽壁虎和蝉花的药物应用。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种以中药壁虎和蝉拟青霉共同发酵形成的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，有效扩展了动物药壁虎的入药方式，并进一步提高了壁虎的药效；本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供上述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法；本专利技术所要解决的第三个技术问题在于提供上述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物用于制备治疗肝癌药物的用途。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法，包括如下步骤：(1)取壁虎药材干燥并粉碎，得到壁虎粉末，备用；(2)向灭菌后的所述壁虎粉末中接入蝉拟青霉菌液，进行菌丝体发酵培养，待长满菌丝后停止发酵；(3)将得到的壁虎-蝉拟青霉固体发酵物进行冷冻干燥，即得。所述步骤(1)中，所述干燥步骤为将所述壁虎药材于35-37℃进行恒温鼓风干燥。所述步骤(2)中，所述壁虎粉末与所述蝉拟青霉菌液的质量体积比为1-2：1-2；所述质量体积比的单位为g/mL的关系；优选所述壁虎粉末与所述蝉拟青霉菌液的质量体积比为1：1。所述步骤(2)中，所述菌丝体发酵培养步骤中，控制培养温度25-30℃，控制相对湿度为60-80％，控制培养时间为12-20d；优选于28℃、相对湿度80％恒温恒湿箱培养16d。所述步骤(2)中，所述蝉拟青霉菌液按照如下步骤制备：挑取保存的蝉拟青霉菌丝无菌接种于PDA固体培养基中，于25-30℃、相对湿度80-90％进行固体活化培养4-7d；挑选活化后的蝉拟青霉菌丝体，无菌接入PDA液体培养基中，于22-30℃、100-160r/min进行摇床培养3-10d，得到蝉拟青霉菌液。所述培养步骤优选于25℃、140r/min摇床培养7d。所述步骤(3)中，所述冷冻干燥步骤中，控制真空度为12-18Pa，控制冷阱温度为-50℃～-54℃，控制冷冻干燥时间为64-80h；优选冷冻干燥时间为72h，真空度为15Pa，冷阱温度为-50℃～-54℃。本专利技术还公开了由所述方法制备得到的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物。本专利技术还公开了一种提取所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的有效成分的方法，即包括取所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物加水进行超声提取的步骤，收集滤液进行冷冻干燥，即得。所述有效成分的提取方法中，还包括将所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物液氮研磨破碎的步骤。优选的，所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物与水的质量比优选为1：5-15，优选为1：10。优选的，所述超声提取步骤中，超声功率为80-100W，温度为4℃，超声1-3h，且每隔半小时将样品摇匀一次；超声提取完后，将样品12000r/min、4℃离心10-20min，取上清，用滤纸过滤，即得所需滤液。所述超声提取步骤中，还包括将离心后的沉淀继续超声2h，且重复3次的步骤，合并上清液经滤纸过滤，即得所需滤液。本专利技术还公开了由所述提取方法提取得到的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物有效成分。本专利技术还公开了所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物或者所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物有效成分用于制备治疗肝癌药物的用途。本专利技术还公开了由所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物或者所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物有效成分，加入常规辅料，按照常规工艺制备的临床上可接受的治疗肝癌的药物制剂。所述药物制剂包括胶囊、片剂、鼻用吸入粉雾剂等常规内服剂型。本专利技术所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，在现有壁虎药材的基础上，以蝉拟青霉菌液进行进一步发酵所得，利用壁虎及蝉拟青霉所特有的药性及功能成分，通过二者的深层次相互作用提升壁虎药材的抗肿瘤功能，可用于制备增强抵抗力、抗肝癌等的医疗保健品及功能性食品，同时扩展了壁虎药材的入药方式，应用前景良好。本专利技术所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物通过加水提取的方式，进一步获得其有效成分，该水提物具有明显的抗HepG2肝癌细胞的生物活性。实验结果表明，本专利技术制备的壁虎-蝉拟青霉固体发酵物水提物对HepG2肝癌细胞有显著的抑制作用，其抑制率范围在60-80％，相比于相同浓度的壁虎水提物的抗HepG2肝癌细胞活性大幅提高，可用于制备治疗肝癌的药物。具体实施方式实施例1本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物，按照如下步骤制备：(1)壁虎预处理：称取若干的干壁虎药材放入35-37℃恒温鼓风干燥箱中进行干燥处理48h，并用粉碎机粉碎，过60目筛，滤过物为所用壁虎粉末，备用；(2)蝉拟青霉菌种活化：用接种环挑取保存的蝉拟青霉菌丝适量，无菌接种于灭菌的PDA固体培养基上，放入28℃、80％湿度的恒温恒湿培养箱中培养5d，得到活化后的菌体；随后，从PDA固体培养基上用接种环挑取适量的蝉拟青霉菌丝体，接入灭菌的PDA液体培养基中，于25℃、140r/min条件下进行摇床培养7d，得蝉拟青霉菌液，备用；双向发酵培养基配制：称取5g过筛后的壁虎粉末置于玻璃平皿中平铺均匀，用牛皮纸包住玻璃平皿，于121℃，灭菌30min；双向发酵：将活化好的蝉拟青霉液体菌按1：1(5mL/5g)比例接入上述灭菌好培养基，于28℃、80％湿度的恒温恒湿箱中，通风黑暗固态发酵培养16d；(3)发酵菌质的处理：当蝉拟青霉长满整个平皿，且外观浓密、洁白时，即为发酵结束；收集发酵产物(包含菌丝及培养基质成分在内的混合物即菌质)用冻干机进行冷冻干燥，控制真空度为15Pa，控制冷阱温度为-52℃，控制冷冻干燥时间为72h至恒重，粉碎后过60目筛，滤过物即为最终产品，-20℃保存即可。实施例2本实施例所述壁虎-蝉拟青霉双向本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种壁虎‑蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取壁虎药材干燥并粉碎，得到壁虎粉末，备用；(2)向灭菌后的所述壁虎粉末中接入蝉拟青霉菌液，进行菌丝体发酵培养，待长满菌丝后停止发酵；(3)将得到的壁虎‑蝉拟青霉固体发酵物进行冷冻干燥，即得。

【技术特征摘要】
1.一种壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取壁虎药材干燥并粉碎，得到壁虎粉末，备用；(2)向灭菌后的所述壁虎粉末中接入蝉拟青霉菌液，进行菌丝体发酵培养，待长满菌丝后停止发酵；(3)将得到的壁虎-蝉拟青霉固体发酵物进行冷冻干燥，即得。2.根据权利要求1所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述壁虎粉末与所述蝉拟青霉菌液的质量体积比为1-2：1-2；所述质量体积比的单位为g/mL的关系。3.根据权利要求1或2所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述菌丝体发酵培养步骤中，控制培养温度25-30℃，控制相对湿度为60-80％，控制培养时间为12-20d。4.根据权利要求1-3任一项所述的壁虎-蝉拟青霉双向固体发酵物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述蝉拟青霉菌液按照如下步骤制备：挑取保存的蝉拟青霉菌丝无菌接种于PDA固体培养基中，于25-30℃、相对湿度80-90％进行固体活化培养4-7d；挑选活化后的蝉拟青霉菌丝体，无菌接入P...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金昶，史新元，连增林，杨芳，
申请(专利权)人：华佑众生北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11