本发明专利技术提供了一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶，其包含与SEQ ID No:1至少90％相同的氨基酸序列。该超高速扩增型Taq DNA聚合酶当扩增片段低于1kb,其延伸速度最快可达到1s/kb,其扩增延伸速率高于市场上普通的Taq DNA聚合酶，因此可以大大节约PCR的扩增时间。利用本发明专利技术建立的制备方法可以得到高纯度Taq DNA聚合酶。
【技术实现步骤摘要】
一种超高速扩增型TaqDNA聚合酶
本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及一种超高速扩增型TaqDNA聚合酶及其应用。
技术介绍
脱氧核糖核苷酸为绝大多数生物的重要遗传物质。DNA聚合酶是一种具有DNA结合和复制能力的热稳定性蛋白，其主要功能是进行DNA的半保留复制和修复。目前现有技术中已经成功克隆表达了多种生物物种的DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶1976年科学家A.Chien从水生嗜热菌(Thermusaquaticus)中分离出来的一种耐热的DNA聚合酶(ChienA，EdgarDB,TrelaJM.DeoxyribonucleicacidpolymerasefromtheextremethermophileThermusaquaticus.[J].Bacteriol,1976,127(3):1550-1557.)。1983年karyMullis专利技术了PCR(polymerasechainreaction)，1988年RandallK.Saiki等首次将TaqDNA聚合酶应用于PCR技术，使得PCR过程实现了自动连续循环。现有技术中TaqDNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，属于DNA聚合酶I类，酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，分子量为94kD。在70℃～75℃时具有最高的生物学活性，在92.5℃酶活性可持续130min，95℃持续40min，97.5℃持续5-6min可保持约50％的酶活性。一般的最适反应温度为75℃，引物在50℃～60℃退火，72℃延伸，可防止引物与模板间的错配及DNA二级结构的形成，从而提高了扩增特异性，且有利于扩增较长的片段，70℃时延伸速率在60核苷酸/秒以上。PCR技术目前广泛应用于生物学、农学和医学等领域，DNA聚合酶的研究和发展也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的主要原因，也成为目前分子生物学和基因工程中必不可少的工具酶。随着基因产业的发展，后基因时代(基因的应用时代)将进行深层次的产业变革，人们将设计和创造许多重要的新生物分子，广泛用于制药、农业、食品、化工、化妆品、环境、能源等领域。PCR技术作为基因研究和编辑的主要手段，对于新性能、高活性、低成本的DNA聚合酶的研究，对于人类的进步和发展都有重大意义。本专利技术因此而来。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种超高速扩增型TaqDNA聚合酶，以解决现有技术中的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种超高速扩增型TaqDNA聚合酶，其特征在于包含与SEQIDNo:1至少90％相同的氨基酸序列。本专利技术的另一目的在于提供一种重组核酸，其特征在于所述重组核酸编码所述的DNA聚合酶。优选的技术方案是所述重组核酸的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。本专利技术的又一目的在于提供一种表达载体，其特征在于包含所述的重组核酸。本专利技术的又一目的在于提供一种宿主细胞，其特征在于包含所述的表达载体。本专利技术的又一目的在于提供一种制备DNA聚合酶的方法，其特征在于所述方法包括：在适合于表达编码DNA聚合酶的核酸的条件下培养所述的宿主细胞。本专利技术的又一目的在于提供一种进行引物延伸的方法，其特征在于包括：在适合于引物延伸的条件下，使所述的DNA聚合酶与引物、核苷酸链模板和核苷三磷酸接触，产生延伸的引物。本专利技术的又一目的在于提供一种产生延伸的引物的试剂盒，其特征在于包含：至少提供所述的DNA聚合酶。本专利技术的又一目的在于提供一种反应混合物，其特征在于包含所述的DNA聚合酶、至少一种引物、核苷酸链模板和核苷三磷酸。本专利技术的又一目的在于提供一种酶制剂，其特征在于包含所述的TaqDNA聚合酶。本专利技术涉及一种TaqDNA聚合酶、基因、质粒、融合蛋白、用途和TaqDNA聚合酶的制备方法。所述TaqDNA聚合酶能够进行脱氧核糖核苷酸扩增反应，且令该反应更容易进行，检测灵敏度更高。所述的融合蛋白有利于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的纯化。本专利技术所述的超高速扩增型TaqDNA聚合酶是从一种水生嗜热菌中分离得到，编码该快速TaqDNA聚合酶核苷酸序列由2499对碱基组成，编码833个氨基酸，分子量约为110KD的。当扩增片段低于1000bp,其延伸速度最快可达到1s/kb,其扩增延伸速率高于市场上普通的TaqDNA聚合酶，因此可以大大节约PCR的扩增时间。本专利技术还提供一种新型快速TaqDNA聚合酶和适用于该酶特性的简单高效的纯化制备方法。所述方法具体步骤包括：(1)合成TaqDNA聚合酶基因片段，并进行序列优化，得到SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；(2)将步骤(1)所得的核苷酸片段连接到基因表达载体中，构建重组质粒；(3)将重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组细胞；(4)对步骤(3)中重组细胞进行诱导表达，收集菌体；(5)破碎步骤(4)中菌体，过滤，收集裂解粗产物；(6)利用镍柱亲和层析所述裂解粗产物，得到所述的TaqDNA聚合酶。优选的技术方案中，所述方法还包括：(7)在步骤(6)利用镍柱亲和纯化后，继续进行离子交换纯化，得到所述的TaqDNA聚合酶进行蛋白定量和质检分装步骤。优选的技术方案中，步骤(4)中诱导表达采用T7表达系统。优选的技术方案中，所述步骤(2)中基因表达载体为pET-28a。优选的技术方案中，所述步骤(3)中宿主细胞为原核细胞。优选的技术方案中，所述步骤(3)中宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21。优选的技术方案中，步骤(4)中诱导表达方法为：挑取步骤(3)中重组细胞阳性单克隆于含有20mM葡萄糖、0.5‰硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基，37℃，220rpm震荡培养5-8h，将培养物1％接种比例接种于含有20mM葡萄糖、0.5‰硫酸卡那霉素和0.3‰的氯霉素TB液体培养基，37℃震荡培养至OD600＝0.6-0.8左右，加入终浓度为0.5mMIPTG，和1％的无水乙醇，220rpm16℃震荡培养16-18h。优选的技术方案中，步骤(6)中采用三步层析纯化，第一次层析缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，50mMKCl，1.5mMMgCl21mMPMSFpH＝8.3；第二次层析缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，500mMKCl，1.5mMMgCl2，1mMPMSFpH＝8.3；第三次层析缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，50mMKCl，1.5mMMgCl2，1mMPMSF，1M咪唑，pH＝8.3。优选的技术方案中，步骤(7)中离子交换层析步骤中选用GE公司生产的HiPerp26/10Desalting进行缓冲液更换，选用GE公司生产的HiTrapQSepharoseFF作离子交换。采用上述方案后，本专利技术与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：本专利技术的快速扩增型TaqDNA聚合酶当扩增片段低于500bp,其延伸速度最快可达到3s/kb,其扩增延伸速率高于市场上普通的TaqDNA聚合酶，因此可以大大节约PCR的扩增时间。利用本专利技术建立的制备方法可以得到高纯度TaqDNA聚合酶。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为本专利技术DNA聚合酶不同浓度SDS-PAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶，其包含与SEQ ID No:1至少90％相同的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种超高速扩增型TaqDNA聚合酶，其包含与SEQIDNo:1至少90％相同的氨基酸序列。2.一种重组核酸，其特征在于所述重组核酸编码根据权利要求1所述的DNA聚合酶。3.根据权利要求2所述的重组核酸，其特征在于所述核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。4.一种表达载体，其特征在于包含权利要求2～3任意一项所述的重组核酸。5.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求4所述的表达载体。6.一种制备DNA聚合酶的方法，其特征在于所述方法包括：在适合于表达编...
【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，杨晟，吴佳梅，
申请(专利权)人：苏州译酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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