一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供了一种生产异麦芽酮糖的方法，此方法为利用可表达编码蔗糖异构酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的枯草芽孢杆菌工程菌全细胞转化生产异麦芽酮糖，利用此方法转化生产异麦芽酮糖，具有转化率、生产强度以及产率高的优势；利用本发明专利技术的方法转化生产异麦芽酮糖9h，即可将反应体系中500g/L的蔗糖转化为443g/L的异麦芽酮糖，蔗糖转化率高达94％、异麦芽酮糖产率高达88.6％、异麦芽酮糖时空产率高达49.2g/L·h。

【技术实现步骤摘要】
一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法
本专利技术涉及一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法，属于基因工程

技术介绍
异麦芽酮糖(isomaltulose,α-D-吡喃葡糖基-1,6-D-果糖)，也称帕拉金糖，是蔗糖的一种同分异构体，有着与蔗糖相似的物理性质和口感，但与蔗糖不同的是，其甜度仅有蔗糖的一半，没有致龋齿性；并且，异麦芽酮糖被人体食用后，在人体血液中释放单糖的速度十分缓慢，不会刺激胰岛素的分泌，尤其适用于糖尿病人和肥胖人群；另外，异麦芽酮糖作为一种还原性功能二糖，是目前唯一没有用量限定的甜味剂，因此，异麦芽酮糖作为一种天然的、新型的功能性糖，被广泛应用在食品领域中。目前，生产异麦芽酮糖的方法主要有以下种：一是微生物转化法，二是酶法生物合成。其中，微生物转化法是通过将普城沙雷氏杆菌属、大黄欧文氏菌属、克雷伯氏菌属和分散泛菌属的一些异麦芽酮糖主产野生型菌株接种至含有蔗糖的培养基中进行发酵以生产得到异麦芽酮糖，此方法通常使菌体发酵和蔗糖转化同步进行，但是，利用此方法生产异麦芽酮糖具有菌体浓度低、转化率低、生产强度弱等缺陷，另外，由于这些异麦芽酮糖主产野生型菌株遗传背景不清楚，可能潜在带有毒性因子，将应用这些菌株发酵得到的异麦芽酮糖应用于食品当中存在极大的安全隐患，因此，综合考虑，野生型菌株的微生物转化法不适用于大规模的工业生产。酶法生物合成也分为两种，一种是先通过构建重组蔗糖异构酶的基因工程菌发酵获得蔗糖异构酶，然后通过发酵获得的蔗糖异构酶以蔗糖作为底物进行催化生产得到异麦芽酮糖；另一种是先构建重组蔗糖异构酶的基因工程菌，然后直接利用此基因工程菌以蔗糖作为底物进行全细胞催化生产得到异麦芽酮糖。此方法由于可在构建表达蔗糖异构酶的基因工程菌时选择绿色高效的食品安全级菌株作为宿主细胞，具有安全性高的优势，因此，酶法生物合成已成为食品用蔗糖异构酶领域的研究热点。但是，由于现有的可表达蔗糖异构酶的基因工程菌均产量不高，其产得的蔗糖异构酶也常存在比酶活低、蔗糖转化率低的缺陷，因此，利用酶法生物合成异麦芽酮糖仍存在底物转化率低、生产强度弱、产率低的缺陷。例如，Jong-YulPark等将肠杆菌属来源的蔗糖异构酶引入乳酸链球菌构建了重组乳酸链球菌MG1363，利用此重组乳酸链球菌MG1363以蔗糖作为底物进行催化生产异麦芽酮糖的底物转化率仅达到72％(具体可见文献：ParkJY,JungJH,SeoDH,etal.MicrobialproductionofpalatinosethroughextracellularexpressionofasucroseisomerasefromEnterobactersp.FMB-1inLactococcuslactisMG1363[J].BioresourceTechnology,2010,101(22):8828-8833.)；Gil-YongLee等将肠杆菌属来源的蔗糖异构酶引入酿酒酵母构建了重组酿酒酵母，利用此重组酿酒酵母以蔗糖作为底物进行催化生产异麦芽酮糖的底物转化率仅达到6.4～7.4％(具体可见文献：LeeGY,JungJH,SeoDH,etal.IsomaltuloseproductionviayeastsurfacedisplayofsucroseisomerasefromEnterobactersp.FMB-1onSaccharomycescerevisiae[J].BioresourTechnol,2011,102(19):9179-9184.)；LingtianWu等将大黄欧文氏菌来源的蔗糖异构酶基因引入枯草芽孢杆菌构建了重组枯草芽孢杆菌，经过培养基优化，发酵35h后，此重组枯草芽孢杆菌发酵上清液中的蔗糖异构酶酶活仅达到5.2U/mL(具体可见文献：WuL,WuS,QiuJ,etal.Greensynthesisofisomaltulosefromcanemolassesby,Bacillussubtilis,WB800-pHA01-palIinabiologicmembranereactor[J].FoodChemistry,2017,229:761-768.)；PengZhang等将分散泛菌来源的蔗糖异构酶基因引入解脂耶氏酵母构建了重组解脂耶氏酵母，利用此重组解脂耶氏酵母以蔗糖作为底物进行催化56h，最终的时空产率仅达到23.8g/L·h左右(具体可见文献：PengZ,Zhi-PengW,JunS,etal.Highandefficientisomaltuloseproductionusinganengineered,Yarrowialipolytica,strain[J].BioresourceTechnology,2018:S0960852418308605-.)。因此，急需找到一种可高产蔗糖异构酶且产得的蔗糖异构酶比酶活高、蔗糖转化率高的重组菌以解决酶法生物合成蔗糖转化率低、生产强度弱、产率低的缺陷。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可高产蔗糖异构酶且产得的蔗糖异构酶比酶活高、蔗糖转化率高的重组菌，以提高酶法生物合成异麦芽酮糖的转化率、产率以及生产强度。[技术方案]本专利技术提供了一段可用于编码蔗糖异构酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，用于构建所述重组质粒的载体为pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体、pXMJ19载体或pDXW-10载体。在本专利技术的一种实施方式中，用于构建所述重组质粒的载体为pMA5载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒是通过将pMA5载体与上述一段可用于编码蔗糖异构酶的基因经限制性内切酶NdeI和MluI酶切后连接获得的。本专利技术还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168。本专利技术还提供了一种生产蔗糖异构酶的方法，所述方法为将上述宿主细胞在培养基中进行培养。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基可为LB培养基、TB培养基或BHI培养基。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养的温度为25～37℃、时间为20～24h。本专利技术还提供了一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法，所述方法为将上述宿主细胞加入含有蔗糖的反应体系中进行转化反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为用含有蔗糖的缓冲液重悬上述宿主细胞至宿主细胞在缓冲液中的细胞浓度为OD600＝25～30，得到反应体系；在反应体系中加入细胞壁通透剂进行转化反应，得到异麦芽酮糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化的温度为25～35℃、pH为6.0～8.0、时间为8～12h。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞壁通透剂为曲拉通。在本专利技术的一种实施方式中，所述蔗糖在反应体系中的浓度为500g/L。本专利技术还提供了上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在生产蔗糖异构酶方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一段可用于编码蔗糖异构酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一段可用于编码蔗糖异构酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.携带权利要求1所述基因的重组质粒。3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，用于构建所述重组质粒的载体为pMA5载体、pHT43载体、pET-20b(+)载体、pXMJ19载体或pDXW-10载体。4.携带权利要求1所述基因或权利要求2或3所述重组质粒的宿主细胞。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。6.一种生产蔗糖异构酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求4或5所述的宿主细胞在培养基中进行培养。7.一种利用全细胞转化生产异麦芽酮糖的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，胡孟凯，刘菲，张显，杨套伟，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32