多中心单鞭毛菌木糖异构酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术发现了一种新的来自多中心单鞭毛菌的木糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术将包含该基因的重组质粒导入宿主细胞中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，将该基因在酿酒酵母中表达后，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母获得了该转化能力。该工程菌通过发酵含有木糖的培养基可以制备乙醇和其他发酵产物。

Xylose Isomerase Gene of Multicenter Monoflagella and Its Application

A new xylose isomerase gene from a multicentric monoflagellate fungus is discovered, and its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.2. The recombinant plasmid containing the gene is introduced into the host cell and a new yeast engineering strain is obtained. Experiments have confirmed that after the gene was expressed in Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, which did not have the ability to transform xylose into xylose, acquired the ability to transform xylose into xylose. The engineering bacteria can produce ethanol and other fermentation products by fermenting xylose-containing medium.

【技术实现步骤摘要】
多中心单鞭毛菌木糖异构酶基因及其应用
：本专利技术涉及一种木糖异构酶基因，具体涉及来自多中心单鞭毛菌的木糖异构酶基因及其转化木糖为木酮糖的功能，本专利技术还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及用该工程菌通过发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。
技术介绍
：将木质素纤维素以产业化方式生产乙醇是既经济又环保的方式。因为来自植物的木质纤维素原料是可以大量获得的可再生资源。但是许多能够发酵生产乙醇的酵母(如酿酒酵母)并不能以木糖作为碳源。因此，需要提供能够利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的酵母。酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，如果能够将植物的木质纤维素中的木糖异构化，生成木酮糖，酿酒酵母就可以代谢木酮糖生成乙醇等产物，木糖就可以作为碳源进行乙醇发酵。如果能够有效地将木糖发酵为乙醇，能使木质纤维素乙醇发酵的产量在原有的基础上增加25％，纤维乙醇生产成本将会降低20％左右。所以木糖发酵产乙醇已成为决定木质纤维素生产乙醇的经济可行的关键因素之一。木糖异构化所需的木糖异构酶(D-Xyloseisomerase，XI，EC5.3.1.5)催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，广泛存在于细菌、少部分真菌中。酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，木酮糖进入磷酸戊糖途径，发酵生成乙醇。如果发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，酿酒酵母就能够将木糖异构化成木酮糖，达到可利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的目的。迄今为止，只有少数几种来自细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是从真菌中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。本专利技术所要解决的技术问题如下：从真菌中筛选出一种新的木糖异构酶基因；提供包含上述木糖异构酶及其基因的重组载体；提供包含上述木糖异构酶基因的重组菌株；将所得上述重组菌株应用于转化木糖生成木酮糖，进而生成乙醇。本专利技术人从一种真菌——多中心单鞭毛菌中获得了一种新的木糖异构酶，命名为XI，并得到了一种编码该酶的木糖异构酶基因xylA，实验证明，该基因具有将木糖转化成木酮糖的功能，适合于在能源、酿酒以及食品工业中使用。虽然本专利技术最初是通过筛选到该真菌完成的专利技术，但本专利技术的结果是得到了基因序列。他人不依赖这种真菌，只要得知序列就可以获得本专利技术的木糖异构酶。所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。该xylA基因编码的木糖异构酶XI的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术将上述木糖异构酶基因xylA插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到包含木糖异构酶基因xylA的重组质粒。所述表达载体优选为酿酒酵母多拷贝组成型表达载体pYES-HXT，得到重组质粒pYES-HXT-XI。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是质粒pYES2上的SpeⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于hxt1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pYES-HXT-XI。本专利技术将上述重组酵母表达质粒pYES-HXT-XI转化进入宿主细胞，得到可以高效表达上述木糖异构酶的重组菌株。所述宿主细胞为酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选宿主细胞为酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae)，更优选的，是将重组酵母表达质粒转化酿酒酵母CEN.PK113-5D，得到重组菌株O1(详见实施例4)。本专利技术还提供了包含上述木糖异构酶基因的重组菌株，优选为重组菌株O1。重组菌株O1能够高效表达上述木糖异构酶，该酶可用于发酵含有木糖的物质，将木糖转化成木酮糖，进而代谢生成乙醇和其他发酵产物。本专利技术还提供了一种所得木糖异构酶的应用，包括以下步骤：1、用权利要求重组质粒转化宿主细胞，得到重组菌株O1(详见实施例4)；2、培养重组菌株O1，表达重组木糖异构酶。其中，本专利技术的木糖异构酶具有以下应用范围：1、能源工业：可以将木质素纤维素水解物中大量存在的的D-木糖转化为D-木酮糖，而D-木酮糖又可被传统的乙醇生产菌株如酿酒酵母转化成有价值的燃料。2、食品工业木糖异构酶可以在体外催化D-葡萄糖转化为D-果糖，因此又被称为“葡萄糖异构酶”。这后一种活性在工业中可用于生产果葡糖浆，可作为食品添加剂。果葡糖浆是一种完全可以替代蔗糖的产品，并与蔗糖一样可广泛应用在食品及饮料行业。具体实施方式以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本专利技术作进一步详细说明，并不对本专利技术的实质内容加以限制。实际上，用本专利技术发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，均不能脱离本专利技术的精神和思路。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。试验材料和试剂1、菌株及载体：酿酒酵母表达载体pYES2购自Invitrogen公司，酿酒酵母菌株T1308-U及大肠杆菌DH5α由所在实验室保存。2、酶类及其它生化试剂：内切酶及连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：①大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、l％NaCl，pH7.0)②酵母培养基YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)③选择培养基SC(0.67％YNB、无菌葡萄糖等对应碳源，平板添加2％琼脂)实施例1多中心单鞭毛菌基因组总DNA的提取①取多中心单鞭毛菌菌株约0.5g，在液氮中迅速研磨成粉；②加入4ml提取液，快速振荡混匀；③加入等体积的4ml的氯仿：异戊醇(24：1)，涡旋3-5min；④10000rpm，4℃，5min；⑤上清用体积的氯仿：异戊醇(24：1)再抽提一次(10000rpm，4℃离心5min)；⑥取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，静置约30min；⑦用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75％乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μlTE中；⑧加入1μlRNaseA(10mg/ml)，37℃处理1h；⑨用酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿：异戊醇(24：1)各抽提1次(10000rpm，4℃离心5min)；⑩取上清，1/10V体积的3MNaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇漂洗，风干，溶于200μlpH8.0的ddH2O中，-20℃保存备用。实施例2多中心单鞭毛菌木糖异构酶基因xylA的克隆以实施例1提取的多中心单鞭毛菌总DNA为模板，进行PCR扩增。扩增得到产物回收后送上海生工生物公司测序，通过比对分析测序序列，证实获得的序列包含木糖异构酶全长基因序列，总长1284bp，序列如SEQIDNO.2所示、实施例3木糖异构酶基因表达载体质粒的构建用编码多中心单鞭毛菌木糖异构酶的基因的5’和3’端序列设计引物，包括Ec本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种木糖异构酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述木糖异构酶基因的用途，是转化木糖生成木酮糖。3.一种木糖异构酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种重组质粒，含权利要求1所述的木糖异构酶基因。5.权利要求4所述的重组质粒，是权利要求1所述木糖异构酶基因与酿酒酵母多...

【专利技术属性】
技术研发人员：王智，顿宝庆，李桂英，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11