【技术实现步骤摘要】
褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒及其检测方法与应用
本专利技术属于环境检测领域，具体涉及一种褐牙鲆卵壳前体蛋白夹心ELISA试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
环境雌激素作为一类外源性化合物进入机体后，具有干扰体内正常分泌物质的合成、释放、运转、代谢、结合等过程，激活或抑制内分泌系统功能，从而破坏其维持机体稳定性和调控作用。近年来，环境中雌激素污染对自然环境的生态平衡及人类的健康构成了潜在的威胁,环境雌激素物质进入人体后，女性多出现子宫肌瘤、卵巢癌等疾病，男性多出现睾丸癌、精子的数量与质量下降等症状。低于1ng/L的雌炔醇能导致雄性魟鳟产生雌鱼特有的卵黄原蛋白，而4ng/L的雌炔醇可导致幼鱼的性畸形，其第二性征发生改变。海洋环境雌激素可导致鱼类种群生存力和渔业资源下降。海洋环境雌激素污染日益严重，其中我国近岸海水中雌二醇、雌炔醇、双酚A等常见雌激素的浓度达到45.7ng/L、3.99ng/L、3920ng/L。因此，为解决我国近海海域环境雌激素活性的检测，亟需建立更灵敏、准确、简便的检测技术。卵壳前体蛋白是近年来新发现的一种环境雌激素生物标志物，是一种雌性...
【技术保护点】
1.一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的夹心ELISA试剂盒，包括空白96孔酶标板1块，包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液各1支，其特征在于还包括褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品1支、鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支、辣根过氧化物酶标记的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支。
【技术特征摘要】
1.一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的夹心ELISA试剂盒，包括空白96孔酶标板1块，包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液各1支，其特征在于还包括褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品1支、鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支、辣根过氧化物酶标记的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支。2.根据权利要求1所述的检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品是用以下方法制备：(1)通过肌肉注射17β-雌二醇诱导褐牙鲆肝脏大量转录ChgHmRNA，用Trizol提取肝脏总RNA，经反转录获得cDNA，以反转后的cDNA为模版，利用引物F:CACCCAAGTTTTCAAGTCTCAGCAGTC，R:CCGCTTACTGAGCAGGGTCAATGAAT进行PCR扩增，回收目的片段；用T4连接酶将目的片段与pClone007载体连接后，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并进行测序，将测序正确的进行扩大培养，抽提质粒，以上述引物进行PCR扩增，切胶回收目的片段；(2)将回收的目的片段与pDE1表达载体连接后，将连接产物转化至表达宿主菌BL21(DE3)；并将正确表达的宿主菌扩大培养，即加入终浓度为0.1mM的IPTG，置于37℃恒温摇床里震荡培养10小时，将培养好的菌液5000rpm离心20min，收集沉淀，经裂解液处理后，再次离心收集包涵体，向包涵体中加入30mL溶解液(100mMTris，500mMNaCl，10mM咪唑，8M尿素，pH8.0)，4℃搅拌过夜；将溶解后的包涵体10000rpm离心30min，收集上清并过0.45μm滤膜，采用镍离子螯合磁珠纯化，即获得褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品。3.根据权利要求2所述的检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的夹心ELISA试剂盒，其特征在于所述的鼠抗褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体是用以下方法制备：将0.1mL含有70µg的上述步骤得到的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品和等体积的弗式完全佐剂乳化后注射入小鼠腹腔，两周后用同样剂量的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品与弗氏不完全佐剂充分乳化后对Balb/c小鼠进行加强免疫，一周后尾静脉注射褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品进行加强免疫，三天后取小鼠的血清，利用ProteinG亲和层析柱从血清中纯化获得免疫球蛋白IgG，纯化的免疫球蛋白IgG经PBS缓冲液透析24h，即获得鼠抗褐牙鲆卵壳前...
【专利技术属性】
技术研发人员：王军，张振忠，汝少国，王蔚，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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