本发明专利技术公开了hnRNPA1的8号外显子跳跃/保留剪接体(hnRNPA1‑a和hnRNPA1‑b)在制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂或含有该诊断试剂的试剂盒中的应用，本发明专利技术具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确的及早观察到慢粒急变期，以便及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。
Reagent and Kit for Diagnosis of Chronic Granulopathy Based on hnRNPA1 Splicing Variant
The present invention discloses the application of hnRNPA1 exon 8 jump/retain splices (hnRNPA1 A and hnRNPA1 b) in the preparation of reagents for the diagnosis of acute phase of chronic myeloid leukemia or kits containing the diagnostic reagents. The present invention has high sensitivity and specificity, and can observe the acute phase of chronic myeloid leukemia more simply, accurately and early, so as to take timely treatment measures and has high sensitivity and specificity. High clinical application value.
【技术实现步骤摘要】
基于hnRNPA1剪接变体诊断慢粒急变期的试剂及试剂盒
本专利技术涉及hnRNPA1剪接变体作为标志物在诊断慢性粒细胞白血病急变期患者中的应用，以及制备相应的检测试剂和试剂盒盒中的应用。
技术介绍
慢性粒细胞性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，约占人白血病的20％。研究发现约95％的CML患者存在异常的细胞遗传学改变，即9号染色体和22号染色体交互易位形成费城染色体(philadelphia，Ph)和Bcr-Abl融合基因。BCR/ABL融合蛋白具有强烈酪氨酸激酶活性，异常激活下游多条信号通路，刺激造血细胞异常增殖和恶性转化。CML的病程通常分为慢性期、加速期及急变期三个阶段，慢性期相对较长且症状可控，如不经合理治疗疾病会不可避免经加速期进展到急变期，而一旦急变，预后极差。针对CML急变的诊断，国内外出台了多套标准。这些标准的诊断指标主要有骨髓/外周血原始细胞计数、细胞克隆演化、脾肿大程度及临床药物反应性等(融合基因bcr/abl定量由于对诊断急变不敏感而未被纳入)。综合而言，这些指标均过于依赖CML细胞生物学表型和临床表现，只在急变发生之后才有一定的诊断价值，而不能在急变前期提供预警，导致临床上一再错失最佳治疗时机。因此，CML急变早期预警、靶向治疗这两个紧密相连的重要环节都亟待寻求突破。可变剪接是指选择性地对前mRNA剪接位点的组合剪接加工，形成不同的成熟mRNA，从而使一个基因产生若干个具有独特结构和功能的蛋白质异构体的过程。近年来的研究表明，可变剪接与疾病例如癌症等的发育、分化有关，许多疾病相关基因受可变剪接调控，回顾研究发现，其中CML的特征融合基因Bcr-Abl的异常选择性可变剪接出现与CML耐药和急变的发生密切相关。Wnt通路作为转录组和蛋白质组多样性的重要驱动因素，调控基因的突变和可变剪接是导致白血病进展和治疗耐药性的重要因素。核内不均一性核糖核蛋白A1基因(heterogeneousnuclearribonucleoproteinsA1,hnRNPA1)属于hnRNP家族，参与核酸代谢的多个过程，包括RNA转录、外显子剪接、前mRNA的成熟和降解等。已有研究报道hnRNPA1存在两种经实验验证的蛋白亚型，全长A1-b亚型为372aa，分子量为38kda，较短的320aa是34kDa为A1-a亚型，其缺失残基253～303。这两个亚型是通过选择性保留/跳跃外显子8产生的，在一些研究中也称之为hnRNPA1外显子7b。虽然前期一些研究报道证实可变剪接在CML的发生发展过程中扮演重要角色，但尚未有可变剪接，包括hnRNPA1可变剪接可能调控前mRNA异常剪接并参与慢粒急变进展的报道，因此，本领域对于慢粒急变的早期、准确和特异性的检测有迫切的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够准确早期预警慢性粒细胞白血病急变期(慢粒急变期)的诊断试剂和诊断试剂盒，以及使用所述试剂或试剂盒预警慢粒急变的方法。本专利技术的一个方面在于提供了hnRNPA1剪接变体用于制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂或含有所述诊断试剂的试剂盒中的用途，所述hnRNPA1剪接变体是hnRNPA1-a亚型(核苷酸序列如SEQIDNO.1)和/或hnRNPA1-b亚型(核苷酸序列如SEQIDNO.2)。所述hnRNPA1-a亚型是hnRNPA1的8号外显子选择性跳跃产生的剪接变体，所述hnRNPA1-b亚型是hnRNPA1的8号外显子选择性保留产生的剪接变体。本专利技术的另一个方面在于：提供了诊断受试者是否处于慢粒急变期的方法，该方法包括至少两个步骤：(a)测定怀疑处于慢性粒细胞白血病急变期的受试者外周血标本中hnRNPA1-a亚型和/或hnRNPA1-b亚型的表达量/结合量；和(b)根据hnRNPA1-a亚型和/或hnRNPA1-b亚型的表达量/结合量，评估该受试者是否处于慢性粒细胞白血病急变期。作为本专利技术优选的实施方案，所述评估包括：(1)将所测定的hnRNPA1-a亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的hnRNPA1-a亚型表达量/结合量低于阈值；或者(4)将所测定的hnRNPA1-b亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的hnRNPA1-b亚型表达量/结合量高于阈值；或者(5)将所测定的hnRNPA1-a亚型和hnRNPA1-b亚型表达量/结合量之比与预确定的阈值进行比较，所测定的hnRNPA1-a亚型和hnRNPA1-b亚型之比低于阈值；指示该受试者处于慢性粒细胞白血病急变期。作为本专利技术优选的实施方案，所述试剂包括检测hnRNPA1-a亚型的核酸扩增引物和/或检测hnRNPA1-b亚型的核酸扩增引物。作为本专利技术优选的实施方案，所述检测hnRNPA1-a亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：GGTAATGATGGAAGCAATTT，下游5'-3'：CCTCCCTTCATGGGTCCAAA，所述检测hnRNPA1-b亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：GAGGCTATGGAAGTGGTGGA，下游5'-3'；CCTCCCTTCATGGGTCCAAA。作为本专利技术优选的实施方案，所述试剂包括检测hnRNPA1-a亚型的核酸探针和/或检测hnRNPA1-b亚型的核酸探针。作为本专利技术优选的实施方案，所述检测hnRNPA1-a和hnRNPA1-b亚型的核酸探针为5'-3'：TTTGGAGGTGGTGGAAGCTACAAT。作为本专利技术优选的实施方案，所述试剂包括抗-hnRNPA1-a亚型蛋白抗体和/或抗-hnRNPA1-b亚型蛋白抗体。本专利技术具有的有益效果为：本专利技术将hnRNPA1剪接变体hnRNPA1-a亚型和/或hnRNPA1-b亚型用于诊断慢性粒细胞白血病急变期，具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确的方法及早观察到疾病进展，及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。附图说明图1为本专利技术中验证预警慢粒急变的hnRNPA1可变剪接的流程示意图；图2为本专利技术中高通量测序hnRNPA1剪接变体差异表达示意图；图3为本专利技术中qPCR验证hnRNPA1剪接变体在各组表达情况图；图4为本专利技术中免疫印迹验证hnRNPA1剪接变体亚型在各组表达情况图；图5为本专利技术中hnRNPA1剪接变体测序验证图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
技术实现思路
所实现的技术均属于本专利技术的范围。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。专利技术人采用高通量技术，通过比较慢粒急变患者、慢粒慢性期患者和正常对照组外周血单个核细胞总RNA可变剪接表达谱的差异，发现hnRNPA1-a剪接亚型在慢粒急变组中有较低的特异性表达。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1一、CML病患和健康对照组标本采集据2016年本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.hnRNPA1剪接变体在用于制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂或含有所述诊断试剂的试剂盒中的用途，所述hnRNPA1剪接变体是hnRNPA1‑a亚型(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和/或hnRNPA1‑b亚型(核苷酸序列如SEQ ID NO.2)。
【技术特征摘要】
1.hnRNPA1剪接变体在用于制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂或含有所述诊断试剂的试剂盒中的用途，所述hnRNPA1剪接变体是hnRNPA1-a亚型(核苷酸序列如SEQIDNO.1)和/或hnRNPA1-b亚型(核苷酸序列如SEQIDNO.2)。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述hnRNPA1-a亚型是hnRNPA1的8号外显子选择性跳跃产生的剪接变体，所述hnRNPA1-b亚型是hnRNPA1的8号外显子选择性保留产生的剪接变体。3.根据权利要求1和2中任一项所述的用途，其特征在于所述诊断包括以下步骤：(a)测定怀疑处于慢性粒细胞白血病急变期的受试者外周血标本中hnRNPA1-a亚型和/或hnRNPA1-b亚型的表达量/结合量；和(b)根据hnRNPA1-a亚型和/或hnRNPA1-b亚型的表达量/结合量，评估该受试者是否处于慢性粒细胞白血病急变期。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述评估包括：(1)将所测定的hnRNPA1-a亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的hnRNPA1-a亚型表达量/结合量低于阈值；或者(2)将所测定的hnRNPA1-b亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的hnRNPA1-b亚型表达量/结合量高于阈值；或者(3)将所测定的hnRN...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小中，李书琪，刘静，张静，黄波，
申请(专利权)人：南昌大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：江西,36
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