一种多环芳烃高效降解菌及其富集筛选方法和应用技术

本发明专利技术属于受污染沉积物生物降解处理技术领域，主要涉及一种多环芳烃高效降解菌及其富集筛选方法和应用，本发明专利技术所提供的多环芳烃高效降解菌是硝基黄杆菌属(Diaphorobacter sp.)YM‑6，该菌能在好氧条件下高效降解菲，于48小时后降解率可达92.3％，本发明专利技术提供的菌株可为多环芳烃降解机理及多环芳烃污染修复提供了新的种质资源。

A PAHs Degrading Bacteria and Its Enrichment Screening Method and Application

The invention belongs to the field of biodegradable treatment technology of contaminated sediments, and mainly relates to a polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria and its enrichment screening method and application. The polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria provided by the invention is Diaphorobacter sp.) YM_6, which can degrade phenanthrene efficiently under aerobic conditions, and the degradation efficiency can reach 92.3% after 48 hours. The invention provides a polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria. The strains can provide new germplasm resources for the degradation mechanism of PAHs and the remediation of PAHs pollution.

【技术实现步骤摘要】
一种多环芳烃高效降解菌及其富集筛选方法和应用
本专利技术属于受污染沉积物生物降解处理
，主要涉及一种多环芳烃高效降解菌及其富集筛选方法和应用
技术介绍
多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，具有疏水性及低水溶性，易吸附于固体颗粒，能长期存在于环境中，是一种持久性有机污染物。目前，持久性有机污染物的方法处理有物理法、化学法、生物修复法等三大类，因多环芳烃的特殊结构，其他修复方式可能不能达到理想的结果，而生物修复法因无二次污染等特点作为多环芳烃的主要修复方式。筛选出多环芳烃的高效降解菌群不仅能快速提高多环芳烃降解速率，而且能反复利用、组合菌群以达到预期效果。沉积物-水界面作为底栖生物的栖息场所和水生生态的重要组成部分，是地球化学循环和生态系统耦合的重要发生区域。水体沉积物是地球上各种人为源和自然源污染物的重要储存库，沉积物中持久性有机污染物一般比上部水体高出1-2个以上数量级。而持久性有机污染物会随着水环境的改变(疏浚、洪水爆发)而从沉积物中释放进入水体，造成二次污染。对沉积物中多环芳烃的治理有着重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种多环芳烃高效降解菌及其富集筛选方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：一种多环芳烃高效降解菌，其特征在于:该菌为硝基黄杆菌属(Diaphorobactersp.)YM-6，革兰氏染色为阴性，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈黄色、圆形、凸起、边缘整齐、光滑湿润。本申请还提供一种多环芳烃高效降解菌的富集筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将沉积物样品加入无菌水中震荡3h，沉积物：无菌水＝1:9；(2)制备富集微生物的培养基，其配方如下(g/L)：K2HPO4·3H2O4.25，NaH2PO4·H2O1，NH4CL2，MgSO4·7H2O0.2，FeSO4·7H2O0.012，MnSO4·H2O0.003，ZnSO4·7H2O0.003，CoSO4·7H2O0.001，pH为7，加入定量的菲作为唯一碳源，制备出不同浓度梯度的富集筛选培养基；筛选单一菌株的平板培养基：富集培养基加入2％的琼脂制成固体培养基，表面喷涂菲-丙酮溶液，待丙酮挥发后使用；(3)将步骤(1)中上清液加入到步骤(2)中培养基中，在30℃、150r/min条件下进行避光培养7天，7天后将菲浓度设置为150mg/L，继续转接培养。依次增加菲浓度进行转接培养，当转接次数大于7次时，可获得多环芳烃高效降解菌群；(4)将步骤(3)中的菌群在平板上进行稀释涂布，挑选单菌落转接至含菲无机盐液体培养基验证降解能力。挑选降解速率大的菌株进行复筛，进行多次平板划线。经多次平板划线后获得多环芳烃高效降解菌株。进一步的，所述原始样品为沉积物。本申请还提供一种多环芳烃高效降解菌的应用，所述多环芳烃高效降解菌应用于降解有机芳香化合物中。进一步的，所述有机芳香化合物为多环芳烃类化合物。本申请还提供了一种多环芳烃的降解方法，利用上述单一菌株进行降解。本申请还提供了一种多环芳烃的降解方法，利用多环芳烃高效降解菌进行降解。与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：本专利技术获得的高效降解菌株对菲的降解率在第二天为92.3％，菌株可耐受高温能在40℃生长且能在偏碱性条件下生长。附图说明图1菌株YM-6降解效率图图2不同初始浓度对菌株YM-6降解效率的影响图3菌株YM-6生长曲线具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体附图，进一步阐明本专利技术。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在限制本专利技术。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。多环芳烃高效降解菌株YM-6的筛选：a、沉积物样品来源：样品取自安徽省马鞍山市六汾河，该河流位于马钢集团建设公司预制构件厂旁边，长期遭受污染。将样品采集至已经完全灭菌的塑封袋中，4℃保存备用。b、富集筛选培养基的配置：其配方如下(g/L)：K2HPO4·3H2O4.25，NaH2PO4·H2O1，NH4CL2，MgSO4·7H2O0.2，FeSO4·7H2O0.012，MnSO4·H2O0.003，ZnSO4·7H2O0.003，CoSO4·7H2O0.001，pH为7，加入定量的菲作为唯一碳源，制备出不同浓度梯度的富集筛选培养基；筛选单一菌株的平板培养基：富集培养基加入2％的琼脂制成固体培养基，表面喷涂菲-丙酮溶液，待丙酮挥发后使用。c、多环芳烃高效降解菌株富集筛选方法：(1)将沉积物样品加入无菌水中震荡3h，沉积物：无菌水＝1:9；(2)将步骤(1)中上清液加入到富集筛选培养基中，在30℃、150r/min条件下进行避光培养7天，7天后将菲浓度设置为150mg/L，继续转接培养。依次增加菲浓度进行转接培养，当转接次数大于7次时，可获得多环芳烃高效降解菌群；(3)将步骤(2)中的菌群在平板上进行稀释涂布，挑选单菌落转接至含菲无机盐培养基验证降解能力。挑选降解速率大的菌株进行复筛，进行多次平板划线。经多次平板划线后获得多环芳烃高效降解菌株。多环芳烃高效降解菌株YM-6的特征与鉴定：对菌株进行革兰氏染色、个体形态观察和菌落特性进行常规鉴定并利用16sDNA对菌株进行序列分析。菌株革兰氏染色为阴性，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈黄色、圆形、凸起、边缘整齐、光滑湿润。从菌株中提取DNA，以菌株DNA为模板利用细胞通用引物F27(5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇)和R1492(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)进行PCR扩增。最后将16sDNA得到的序列在TheRibosomalDatabaseProject基因数据库进行序列对比。经过基因数据对比(表1)，发现YM-6的序列与硝基黄杆菌属(Diaphorobacter)序列的相似度达到99％，经对菌株的形态、菌落特征观察和DNA序列对比，初步鉴定为硝基黄杆菌属(Diaphorobacter)。多环芳烃高效降解菌株YM-6的降解效果及污染物浓度对菌群降解效率的影响：将菌株在无菌操作条件下，将菌株转接至LB培养基，过夜培养；将过夜培养的菌液6000r离心十分钟收集菌体，用生理盐水洗涤3次后制成悬菌液；将菌悬液按10％的投加量加入100mg/L的含菲无机盐培养基，在150r、30℃的条件下进行避光摇瓶培养；设菲浓度分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L，在150r、30℃的条件下进行避光摇瓶培养；液体中菲浓度的检测：样品用等体积的正己烷萃取三次，合并萃取液。后旋转蒸发至5ml过无水硫酸钠柱子，接着氮吹至1ml，加入和样品等体积的甲醇进行定容。过滤膜待上液相检测。液相检测条件：柱温30℃；甲醇：水(v：v)＝90:10；进样量：20ul。降解率计算公式：其中C0为原始浓度；C1为降解过程中菲得剩余浓度。最终结果证实:当菲浓度为100mg/L时，2天后降解率达到92.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多环芳烃高效降解菌，其特征在于：所述多环芳烃高效降解菌为硝基黄杆菌属(Diaphorobacter sp.)YM‑6，革兰氏染色为阴性，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈黄色、圆形、凸起、边缘整齐、光滑湿润。

【技术特征摘要】
1.一种多环芳烃高效降解菌，其特征在于：所述多环芳烃高效降解菌为硝基黄杆菌属(Diaphorobactersp.)YM-6，革兰氏染色为阴性，菌体形态为无芽孢杆菌，菌落呈黄色、圆形、凸起、边缘整齐、光滑湿润。2.如权利要求1所述的多环芳烃高效降解菌的富集筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将沉积物样品加入无菌水中震荡3h，沉积物：无菌水＝1:9；(2)制备富集微生物的培养基，其配方如下(g/L)：K2HPO4·3H2O4.25，NaH2PO4·H2O1，NH4CL2，MgSO4·7H2O0.2，FeSO4·7H2O0.012，MnSO4·H2O0.003，ZnSO4·7H2O0.003，CoSO4·7H2O0.001，pH为7，加入定量的菲作为唯一碳源，制备出不同浓度梯度的富集筛选培养基；筛选单一菌株的平板培养基：富集培养基加入2％的琼脂制成固体培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：王萍，张永敏，张海婷，王天慧，张深圳，
申请(专利权)人：安徽工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34