Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途制造技术

本发明专利技术公开了野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1基因(Wip1)及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途。本发明专利技术通过体内实验证实在SOD1G93A ALS小鼠中Wip1的表达明显下降且与疾病的发生和发展密切相关，在神经元细胞中通过基因调控过表达Wip1基因，能够通过抑制DNA损伤应答机制促进神经元的存活，提示高表达上述原癌基因Wip1可治疗肌萎缩侧索硬化，本发明专利技术还公开了一种用于治疗肌萎缩侧索硬化的聚合物纳米颗粒，通过给药靶向受试者的脑和脊髓的运动神经元，用于治疗肌萎缩侧索硬化。本发明专利技术的提出为肌萎缩侧索硬化的预防和治疗提供了新的技术手段。

Application of Wip1 Gene and Its Expressed Protein in the Treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis

The invention discloses the use of wild type p53-induced protein phosphatase 1 gene (Wip1) and its expressed protein in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis. The present invention has been proved by in vivo experiments that the expression of Wip1 in SOD1G93A ALS mice is significantly decreased and is closely related to the occurrence and development of disease. Overexpression of Wip1 gene in neuron cells through gene regulation can promote the survival of neurons by inhibiting DNA damage response mechanism, suggesting that overexpression of the proto-oncogene Wip1 can treat amyotrophic lateral sclerosis, and the present invention also discloses 1. Polymer nanoparticles for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) were designed to target motor neurons in the brain and spinal cord of subjects by drug delivery. The invention provides a new technical means for the prevention and treatment of amyotrophic lateral sclerosis.

【技术实现步骤摘要】
Wip1基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途
本专利技术涉及一种基因治疗肌萎缩侧索硬化的方法，特别涉及野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1)基因及其表达蛋白在治疗肌萎缩侧索硬化中的用途，本专利技术属于神经生物

技术介绍
肌萎缩侧索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis,ALS),又称“渐冻人症”，是一种致命性的神经退行性疾病。主要累及上、下运动神经元，表现为进行性的肌无力和萎缩，平均生存期3-5年。最新的流行病学统计显示，ALS的患病率约为每年每十万分之五。大约有20％的家族性ALS与SOD1基因突变密切相关。目前研究认为，ALS的发病机制主要与RNA代谢紊乱、蛋白质稳态异常、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、DNA损伤、胶质细胞病变及细胞内核质运输障碍等有关。最新研究预计到2040年，全球ALS患者将在2015年(222801人)的基础上增加69％。尽管ALS已经对人类的健康产生了越来越大的威胁，并给家庭和社会带来了沉重的负担，但到目前为止仍然没有控制疾病的有效手段。FDA批准的第一个口服药物利鲁唑(Riluzole)，价格昂贵，且仅能延长患者生命约3-4个月；2017年FDA最新批准的自由基清除药物依达拉奉(Edaravone)，早期临床研究仍存在争议，且目前研究提示依达拉奉似乎不适用于所有类型的ALS患者。由于RNA或蛋白介导的毒性是ALS最常见的致病机制，因此通过基因治疗的手段减少毒性的RNA或蛋白并通过调控基因表达来起到保护运动神经元的作用已经成为了目前研究的前沿。虽然人类的基因治疗仍然处在初始阶段，但一系列早期临床试验已经证实了这种治疗手段的安全性和有效性。目前对于ALS的基因治疗研究主要基于反义寡核苷酸(ASOs)、腺病毒(AAV)/慢病毒(LV)载体以及间充质干细胞慢病毒载体系统。ASOs靶向SOD1的最新研究已经进入了I期临床阶段，研究表明SOD1ALS患者在鞘内给予3mgISIS333611没有显示出毒性和严重的不良反应；然而对ISIS33611的I期试验发现突变SOD1蛋白的含量并没有减少，而改良的SOD1ASO(BIIB067或IONIS-SOD1Rx)的I期临床试验目前正处于研究阶段。在ALS/FTD患者iPSC(可诱导的多能干细胞)诱导的神经元中用ASOs靶向扩增的C9ORF72减少了毒性RNA的聚集和谷氨酸的毒性。最新研究表明，给予C9ORF72ALS小鼠侧脑室注射ASOs靶向C9ORF72重复扩增片段能够减少RNA聚集和二肽重复蛋白并改善了与衰老相关的行为学表现。目前鞘内给予靶向C9ORF72的ASOs的1期临床试验(NCT03626012)正处于募集受试者阶段。在ALS中以腺病毒/慢病毒为载体的基因治疗目前主要以动物研究为主。多个研究小组的研究证实应用AAV/LV载体投递shRNA能够通过敲减SOD1延长ALSG93A大鼠模型的生存期。肌内给予以AAV/LV为载体的神经营养因子(GDNF、IGF-1和VEGF)，能够延缓ALSSOD1-G93A大鼠的发病，改善其行为和运动功能并延长生存期，而通过直接靶向中枢神经系统的给药方式，如侧脑室注射、椎管内注射或小脑注射投递这些以病毒为载体的神经营养因子也起到了部分挽救疾病表型和延长ALS大鼠生存期的作用。体外实验以LV为载体在细胞中表达抗氧化基因能够减少氧化应激的水平促进细胞的存活。在ALSTDP43小鼠模型中以AAV为载体给予hUPF1基因治疗能够改善大鼠的前肢功能。此外，间充质干细胞治疗方式也受到研究者的普遍关注，研究表明在SOD1-G93A大鼠中移植用LV载体表达GDNF的人间充质干细胞，能够对ALSSOD1-G93A大鼠的骨骼肌、运动神经元和神经肌肉接头起到神经保护作用，并增加存活。另一项研究应用LV载体系统在人间充质干细胞中过表达VEGF和GDNF，能够延长SOD1-G93AALS大鼠的生存期，维持脊髓前角运动神经元和神经肌肉接头的功能。除此之外，在运动神经元疾病中基因治疗已经取得突破性的进展，一种反义寡核苷酸药物——Spinraza，目前已经获得了FDA的批准用于治疗脊肌萎缩症(SMA)。综上，尽管目前在基因治疗领域的研究已经受到了越来越多的关注，但基因治疗仍然面临很多挑战：无效的给药方式以及血脑屏障的阻碍严重影响了治疗效果，如反义寡核苷酸不能通过血脑屏障(BBB)而只能通过鞘内注射的方式给药；仍然缺乏靶向中枢神经系统特定部位或者细胞亚型的给药方式；以及生产用于临床的大量病毒载体需要昂贵的成本，此外病毒载体不仅可以激活宿主的免疫系统，还能诱导免疫记忆的产生影响后期再应用病毒载体的疗效。纳米载体(nano-vectors)是近年来研究的一类安全、高效、理想的新型基因治疗载体，它是以纳米微粒为载体，将目的基因包含于微粒内部或吸附于表面，利用纳米微粒的小尺寸效应、比表面效应、界面效应等性质将目的基因转移到靶细胞内部，释放目的基因，从而达到基因治疗的最终目的。与病毒载体相比，纳米载体通过将质粒DNA压缩成纳米级微粒，不但可以避免核酸降解，而且可以高效的介导DNA向细胞内转染，同时也避免了应用病毒载体带来的细胞毒性、免疫原性及潜在的致瘤性等缺点，更重要的是，利用不同的表面修饰，纳米载体能够有效决定外源基因在体内的走向、定位传递以及高效表达，从而表现出优越的靶向性。因此纳米载体的出现，将在很大程度上改善中枢神经系统给药生物利用度低以及无法通过血脑屏障(BBB)等的情况，但是到目前为止，尽管在阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)领域已经有很多基于纳米载体给药系统的研究，但在ALS治疗领域的研究仍非常有限。早期研究表明，通过共价连接将利鲁唑与碳纳米管(CNTs)结合没有影响利鲁唑的药物活性，对细胞也无毒性作用。用固体脂质纳米颗粒(SLNs)包裹利鲁唑制成88nm带负电荷的化合物，通过腹腔注射途径给药，显示出比普通利鲁唑更高的脑组织靶向性和更低的非特异性生物分布。体内实验在ALSSOD1G93A小鼠中通过侧脑室注射的给药方式，将用脂多糖修饰的包裹抗炎药物(米诺环素)的脂质体直接靶向小胶质细胞的TLR4受体，增加了药物的摄取率并减缓了疾病的进展。最新研究表明，磷酸钙脂质纳米颗粒配方包裹SOD1ASO在显微镜下注射在斑马鱼体内，成功的在其脑组织、脊髓和血液中检测到纳米颗粒，证实磷酸钙脂质纳米颗粒是一种安全有效基因载体，改善了ASO到运动神经元的给药途径。将具有抗氧化特性的氧化铈纳米颗粒通过尾静脉注射途径注入ALSSOD1G93A小鼠中，延长了ALS小鼠的平均生存期。目前对于纳米基因载体靶向治疗ALS的相关研究尚未见报道。最近很多研究以狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein，RVG)作为靶向脑组织的配体并在传递siRNA载体的表面进行修饰，如三甲烯壳聚糖，甘露糖醇-聚乙烯亚胺，外泌体，以及通过全身注射的方式将siRNA传递到脑组织中。然而，仅仅传递基因穿越血脑屏障是不够的，中枢神经系统中有多种细胞亚型，因此为了确保基因传递的安全性和有效性，我们需要能够靶向神经元的纳米传递基因系统。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild‑type p53‑inducible phosphatase 1,Wip1)及其表达蛋白在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。

【技术特征摘要】
1.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1)及其表达蛋白在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物为通过纳米载体结合Wip1基因制备得到的纳米颗粒、凝胶或乳剂，所述纳米颗粒包含但不限于聚合物纳米颗粒、脂质纳米颗粒、碳纳米颗粒、金属纳米颗粒。4.野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-typep53-induciblephosphatase1,Wip1)及其表达蛋白的增效剂在制备治疗肌萎缩侧索硬化药物中的用途。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物通过抑制DNA损伤应答途径和增加神经元的存活，用于改善由SOD1G93A突变导致的肌萎缩侧索硬化。6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的增效剂为激动剂、上调剂或稳定剂。7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的增效剂是指任何可提高Wip1基因或蛋白的活性、提高Wip1基因或蛋白的稳定性、上调Wip1基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：丰宏林，杨悦青，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23