一种白及愈伤组织的诱导培养方法技术

本发明专利技术涉及中药材药物研究技术领域，涉及一种愈伤组织培养方法，具体涉及一种白及愈伤组织的诱导培养方法，包括对白及种子的愈伤组织诱导培养和对愈伤组织的继代培养，所述愈伤组织诱导培养和所述继代培养均采用悬浮培养的方式，且均使用含有植物生长调节剂的MS液体培养基。植物生长调节剂为6‑苄氨基嘌呤、2,4‑二氯苯氧乙酸和萘乙酸。本发明专利技术可以易化对白及愈伤组织生长分化最佳条件进行研究的过程，减小毒性次生代谢产物对白及愈伤组织的影响，提供一个相对一致的白及愈伤组织细胞群体等。本发明专利技术可以应用到白及愈伤组织悬浮培养生产次生代谢产物的工业化生产中。

A Method of Induction and Culture of Callus of Bletilla striata

The invention relates to the technical field of Medicinal Research of Chinese medicinal materials, and relates to a method of callus culture, in particular to a method of induction and culture of white and white callus, including callus induction and culture of white and white seeds and subculture of callus. The callus induction and subculture of white and white seeds adopt suspension culture method, and all of them use plant growth containing plant growth. MS liquid medium with regulator. Plant growth regulators are 6 benzylaminopurine, 2,4 dichlorophenoxyacetic acid and naphthalene acetic acid. The invention can facilitate the process of studying the optimum conditions for growth and differentiation of white and white callus, reduce the influence of toxic secondary metabolites on white and white callus, and provide a relatively uniform white and white callus cell population, etc. The invention can be applied to the industrial production of secondary metabolites produced by suspension culture of Baiji callus.

【技术实现步骤摘要】
一种白及愈伤组织的诱导培养方法
本专利技术涉及中药材药物研究
，涉及一种愈伤组织培养方法，具体涉及一种白及愈伤组织的诱导培养方法。
技术介绍
白及(Bletillastriata(Thunb.)Rchb.f.)为兰科白及属的多年生草本药用植物，在我国主产于长江流域、甘肃、陕西等地。白及是我国传统的名贵中药材，药用价值广泛。历代药典记录其具有收敛止血、消肿生肌的功效，可用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等疾病。现代药理学研究表明，白及具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗消化性溃疡、免疫调节等作用。除了在药用方面的应用，白及还被用作工业、园艺等的原材料，其用途还在不断拓展，人们对白及的需求量正在急速增加。由于生态环境的破坏和过度采挖，野生白及的种群类型和数量急剧下降，濒临灭绝，急需开展种质资源保护和拓展、新品种选育、种苗快繁等方面的研究，而愈伤组织的诱导和繁育是这些研究的良好基础。因此，建立和优化出白及愈伤诱导和增殖培养的培养基配方和技术体系具有十分重要的基础研究和应用实践的价值。专利技术人对白及的愈伤组织诱导和繁育进行了大量研究，在学术论文(不同激素配比对白及愈伤组织诱导、增殖和分化的影响，徐德林等，北方园艺，2016)中公布了一种白及愈伤组织诱导、增殖和分化的方法。其中，白及愈伤组织诱导采用的培养基为含6-苄氨基嘌呤(6-BA)或2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS固体培养基，增殖培养采用的培养基为含6-苄氨基嘌呤(6-BA)或2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS固体培养基。在完成白及愈伤组织诱导后，需要将愈伤组织从诱导培养基中取出，对愈伤组织进行清洗等各种处理，再放入继代培养基中进行增殖(继代)培养。上述操作非常繁琐，从固体的诱导培养基取出愈伤组织以及后续处理的过程易损伤愈伤组织，因愈伤组织生长时有一个生长核心，一旦破坏，愈伤组织就难以恢复分裂和生长。并且选择固体的增殖培养基不利于愈伤组织形成分散性好的游离小细胞团，难以为后续的诱导分化培养提供性质均一的愈伤组织。另外，采用固体的诱导培养基和继代培养基，不利于调节控制培养基中各营养物质和激素等的水平，不利于对诱导培养方法和过程进行优化和完善。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是提供一种白及愈伤组织的诱导培养方法，该诱导培养方法采取悬浮培养的方法对白及愈伤组织进行诱导和继代培养，并提供了一种愈伤组织诱导培养和继代培养的培养基。该方法可以易化对白及愈伤组织生长分化最佳条件进行研究的过程，减小毒性次生代谢产物对白及愈伤组织的影响，提供一个相对一致的白及愈伤组织细胞群体等。为达到上述目的，本专利技术提出了以下技术方案：一种白及愈伤组织的诱导培养方法，包括对白及种子的愈伤组织诱导培养和对愈伤组织的继代培养，所述愈伤组织诱导培养和所述继代培养均采用悬浮培养的方式，且均使用含有植物生长调节剂的MS液体培养基。采用上述技术方案，技术原理为：使用含有植物生长调节剂的MS液体培养基对白及种子进行悬浮培养以诱导愈伤组织的产生；使用含有植物生长调节剂的MS液体培养基对白及愈伤组织进行悬浮培养以促进白及愈伤组织的增殖。愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。植物外植体(白及种子)在培养基的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织。外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。MS培养基为含盐量较大的培养基，比较适合愈伤组织诱导和愈伤组织的继代培养，高盐浓度的培养基对培养过程中愈伤组织数量及鲜重的增加有利。植物生长调节剂可以促进白及种子中的细胞脱分化，刺激白及细胞改变原有的遗传程式，刺激白及细胞分裂，最终形成愈伤组织，并刺激愈伤组织继续分裂生长。悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。本技术方案的有益效果具体如下：本技术方案在愈伤组织诱导培养和继代培养中，均采用悬浮培养的方式。而现有技术中，愈伤组织诱导培养和继代培养均采用固体培养基对外植体进行愈伤组织诱导和继代培养。现有技术的方案存在较多缺陷。缺陷1：固体培养基配制完成后，较难对培养基成分和培养基含氧量等因素进行调控，不利于对白及愈伤组织生长分化最佳条件进行研究。缺陷2：愈伤组织在固体培养基中产生的次生代谢产物聚集在愈伤组织周围，不能或较难扩散到培养基的其他部位，从而导致待培养愈伤组织周围次生代谢产物聚集过多，其中一些毒性产物对愈伤组织的分裂以及生长造成了负面影响，使得愈伤组织出现大量褐化现象。缺点3：愈伤组织吸收利用完周边固体培养基的营养物质或植物生长调节剂后，难以利用较远位置的培养基中的物质，使得固体培养基物质利用率低。缺点4：在固体培养基中，愈伤组织细胞大量聚集，分散度很低，导致具有不同分化潜能的愈伤组织细胞团聚集，不能提供相对一致的细胞群体，不利于后期的诱导分化的进行，也不利于对植物的生理生化、胚胎发生、基因表达等方面的研究。缺点5：固体培养基不利于调节培养基中含氧量，从而不利于通过调节氧气含量来控制愈伤组织的生长状态，而在悬浮培养体系中，可以通过多种方式实现对培养基中含氧量的调节。采用悬浮培养的方法可克服上述缺陷，可以易化对白及愈伤组织生长分化最佳条件进行研究的过程，减小毒性次生代谢产物对白及愈伤组织的影响，提供相对一致的白及愈伤组织细胞群体等。现有技术中，白及的愈伤组织诱导和继代培养通常采用固体培养基进行。特别是对于愈伤组织诱导，人们通常认为植物细胞脱分化的过程需要将外植体的细胞生长和分裂水平维持在一个较低的水平，将外植体置于固体培养集中静置培养，可使得培养基中化学物质作用于已有的植物细胞，从而促进细胞脱分化。通常认为，过高的外植体细胞生长和分裂水平，不利于培养基环境对细胞脱分化的促进。通过研究发现，悬浮培养可以使得外植体细胞和植物生长调节剂以及其他物质充分混合，虽然悬浮培养使得外植体细胞生长和分裂的水平增加，但悬浮培养仍然可以较为高效的促进外植体愈伤组织的形成。本方案克服了技术偏见，采用了悬浮培养的方法诱导白及种子愈伤组织的产生，以及促进愈伤组织的继代培养。愈伤组织诱导培养和继代培养采用相同的培养基，可简化培养步骤。通常在愈伤组织诱导培养之后转培养基时，需要对愈伤组织进行清洗处理，以消除愈伤组织诱导培养基中的化学物质对后续采用的继代培养基的影响。愈伤组织诱导培养和继代培养采用相同的培养基，可以省略上述步骤，并且操作方便，简单实用，特别适合于进行大量对照实验或工业化生产愈伤组织(利用愈伤组织制造某天然物质)等的情况。综上所述，本技术方案的有益效果为：(1)提供相对一致的细胞群体，利于后期的诱导分化的进行；(2)防止毒性次生代谢产物积累，从而促进愈伤组织形成和生长；(3)可通过调节氧气含量来控制愈伤组织的生长状态；(4)提供相对一致的白及愈伤组织细胞群体；(5)易化对白及愈伤组织生长分化最佳条件进行研究的过程；(6)愈伤组织诱导培养和继代培养采用相同的培养基，可简化培养步骤。进一步，所述植物生长调节剂包括了6-苄氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸和萘乙酸三种物质组成的混合物。采用上述技术方案，6-苄氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白及愈伤组织的诱导培养方法，包括对白及种子的愈伤组织诱导培养和对愈伤组织的继代培养，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养和所述继代培养均采用悬浮培养的方式，且均使用含有植物生长调节剂的MS液体培养基。

【技术特征摘要】
1.一种白及愈伤组织的诱导培养方法，包括对白及种子的愈伤组织诱导培养和对愈伤组织的继代培养，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养和所述继代培养均采用悬浮培养的方式，且均使用含有植物生长调节剂的MS液体培养基。2.根据权利要求1所述的一种白及愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述植物生长调节剂包括了6-苄氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸和萘乙酸三种物质组成的混合物。3.根据权利要求2所述的一种白及愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，6-苄氨基嘌呤在MS液体培养基中的含量为：0.300-1.000mg/L；2,4-二氯苯氧乙酸在MS液体培养基中的含量为：1.270-2.000mg/L；萘乙酸在MS液体培养基中的含量为：0.262-1.000mg/L。4.根据权利要求3所述的一种白及愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述MS液体培养基含有20-30g/L的蔗糖。5.根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的一种白及愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，在所述愈伤组织诱导培养和所述继代培养中，MS液体培养基的pH为...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐德林，上官艳妮，李树刚，何毅怀，李林，潘胤池，刘厚伯，李杰，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52