一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法技术

本发明专利技术公开了一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法。该方法包括如下步骤：(1)用TAK1抗体处理肿瘤组织，然后测定肿瘤组织中TAK1的表达水平，得到R1；同时，用TAK1抗体处理其肿瘤旁边的正常组织，再测定正常组织中TAK1的表达水平，得到R2；(2)比较R1和R2，若R1＜R2差异有显著性，则预测TAK1能与药物协同促进肿瘤细胞凋亡；反之，若R1＞R2差异有显著性，则预测TAK1不能与药物协同促进肿瘤细胞凋亡，并预测TAK1抑制剂与药物协同促进肿瘤细胞凋亡。该方法可根据肿瘤和瘤旁组织中TAK1的表达水平预测TAK1是否能有效协同药物促进细胞凋亡，为后续的科学研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法
本专利技术涉及细胞内信号转导领域，特别涉及一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法。
技术介绍
TAK1(TGF-β-activatedkinase1)，是MAPK家族的丝氨酸苏氨酸激酶[1]。TAK1参与调节一系列的细胞过程，包括发育、分化、自噬、凋亡和存活。TAK1是JNK、p38、NFκB等多个细胞内信号转导通路中的关键蛋白激酶，TAK1及其结合蛋白TAB1(TGF-betaactivatedkinase1bindingprotein1)通过JNK、p38、NFκB信号转导通路在细胞凋亡过程中发挥重要作用[2-6]。紫杉醇可作用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、精原细胞瘤、淋巴瘤等多种组织来源细胞，诱导DNA断裂、细胞核固缩、凋亡小体形成等典型细胞凋亡表现[7-8]。TAK1与紫杉醇联合作用，通过JNK、p38、NFκB信号转导通路影响细胞凋亡。目前国内外已经有多篇文献报导，TAK1或TAK1抑制剂影响不同组织来源的肿瘤细胞凋亡，包括乳腺癌、神经母细胞瘤、宫颈癌、急性淋巴细胞白血病、结肠癌、肺癌等[9-16]。TAK1是众多细胞信号转导通路的关键蛋白激酶，也预示TAK1对于不同组织来源、甚至不同个体来源的细胞，可能通过不同细胞内信号通路，发挥不同作用。TAK1,也可能是TAK1抑制剂促进细胞凋亡。在后续的科学研究中，如何预测、评估TAK1还是其抑制剂对于不同组织来源细胞具有促细胞凋亡作用是我们必须面对的问题。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法。本专利技术的另一目的在于提供用于测定肿瘤组织和瘤旁组织中TAK1的表达水平的试剂在制备用于预测TAK1与药物是否能协同影响肿瘤细胞凋亡的试剂盒中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，包括如下步骤：(1)用TAK1抗体处理肿瘤组织，然后测定肿瘤组织中TAK1的表达水平，得到R1；同时，用TAK1抗体处理其肿瘤旁边的正常组织，再测定正常组织中TAK1的表达水平，得到R2；(2)比较R1和R2，若R1＜R2差异有显著性，则预测TAK1能与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡；反之，若R1＞R2差异有显著性，则预测TAK1不能与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡，并预测TAK1抑制剂与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡。步骤(1)中所述的肿瘤组织是肿瘤组织活检或完整或部分的外科切除获得的肿瘤组织；包括肾癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌组织等。步骤(1)中所述的TAK1抗体与肿瘤组织的体积比为1：200～500。步骤(1)中所述的肿瘤旁的正常组织为去除对应肿瘤后的正常组织，选择同一个体肿瘤病灶周围，形态及病理检测确认正常的组织，范围不限。步骤(1)中所述的TAK1的表达水平的测定可通过现有技术中的常规方法进行测定；优选为通过免疫组化，流式细胞术检测、定量PCR、和免疫印迹中的至少一种方法进行测定。所述的免疫组化通过如下步骤实现：计算阳性细胞百分比，重复3次以上，再计算其均值，得到TAK1的表达水平。所述的流式细胞检测优选为通过如下步骤实现：测定计算阳性细胞百分比，重复3次以上，再计算其均值，得到TAK1的表达水平。所述的定量PCR优选为通过如下步骤实现：计算逆转录后cDNA拷贝数，重复3次以上，再计算其均值，得到TAK1的表达水平。所述的免疫印迹法优选为通过如下步骤实现：测定全细胞抽提物中TAK1的表达量，重复3次以上，再计算其均值，得到TAK1的表达水平。步骤(2)中所述的差异有显著性为通过如下方法进行判断：先进行方差齐性检验，若方差齐则使用两样本均数t检验比较，若方差不齐则使用t’检验比较，当P＜0.05时，认为差异有显著性。步骤(2)中所述的药物为抗肿瘤药物；优选为紫杉醇。步骤(2)中所述的TAK1抑制剂优选为5Z-7-oxozeaenol，也可以使用TAK1基因编辑质粒沉默TAK1基因。所述的TAK1的基因编辑质粒优选为TAK1/TAB1eCRISPR质粒。所述的预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，在步骤(2)之后还包括进一步验证的步骤；所述的验证可通过如下任一种或两种方法实现：(a)免疫印迹法TAK1/TAB1与药物联合使用：将与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞分别转染空载质粒、含有TAK1的质粒、以及含有TAK1和TAB1的质粒，然后将转染后的细胞培养48或72小时后加入药物处理9～18h，裂解细胞获得全细胞抽提物，再用免疫印迹法检测PARP剪切；若检测结果显示与转染空载质粒的肿瘤细胞相比，转染含有TAK1的质粒以及含有TAK1和TAB1的质粒的肿瘤细胞的PARP剪切增强，则验证TAK1与药物协同促进细胞凋亡；反之，若与转染空载质粒的肿瘤细胞相比，转染含有TAK1的质粒以及含有TAK1和TAB1基因的质粒的肿瘤细胞的PARP剪切减弱，则验证TAK1不能与药物协同促进肿瘤细胞凋亡；(b)流式细胞术TAK1/TAB1与药物联合使用：将与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞分别转染空载质粒、含有TAK1的质粒、含有TAK1和TAB1的质粒、和/或转染沉默TAK1基因的编辑质粒，同时向未转染质粒的肿瘤细胞中加入TAK1抑制剂，然后将细胞培养48或72小时后加入药物处理9～18h，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率；若检测结果显示与转染空载质粒的肿瘤细胞相比，转染含有TAK1的质粒以及含有TAK1和TAB1的质粒的肿瘤细胞的凋亡率升高，则验证TAK1与药物协同促进细胞凋亡；若检测结果显示与转染空载质粒的肿瘤细胞相比，转染含有TAK1的质粒以及含有TAK1和TAB1的质粒的肿瘤细胞的凋亡率降低，则验证TAK1不能与药物协同促进肿瘤细胞凋亡；若检测结果显示与转染空载质粒的肿瘤细胞相比，加入TAK1抑制剂或转染沉默TAK1基因的编辑质粒的细胞凋亡率升高，则验证TAK1抑制剂或沉默TAK1基因协同药物促进细胞凋亡。方法(a)和(b)中所述的空载质粒优选为pcDNA3.1空载质粒或pHBLV-MCS-3FLAG空载质粒。方法(a)和(b)中所述的含有TAK1基因的质粒为真核细胞表达质粒；优选为pcDNA3.1-TAK1-myc质粒或pHBLV-MCS-3FLAG-TAK1质粒。方法(a)和(b)中所述的含有TAB1基因的质粒为真核细胞表达质粒；优选为pcDNA3.1-TAB1-myc质粒或pHBLV-MCS-3FLAG-TAB1质粒。方法(a)和(b)中所述的沉默TAK1基因的编辑质粒优选为TAK1/TAB1eCRISPR质粒(购自PublicProtein/PlasmidLibrary,China)。方法(b)中所述的TAK1抑制剂优选为5Z-7-oxozeaenol。方法(b)中所述的加入的TAK1抑制剂的用量为按其在体系中的终浓度为5～10μM计算；优选为按其在体系中的终浓度为5μM计算。方法(b)中所述的沉默TAK1基因为采用TAK1的基因编辑质粒如TAK1/TAB1eCRISPR质粒沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用TAK1抗体处理肿瘤组织，然后测定肿瘤组织中TAK1的表达水平，得到R1；同时，用TAK1抗体处理其肿瘤旁边的正常组织，再测定正常组织中TAK1的表达水平，得到R2；(2)比较R1和R2，若R1＜R2差异有显著性，则预测TAK1能与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡；反之，若R1＞R2差异有显著性，则预测TAK1不能与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡，并预测TAK1抑制剂与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡。

【技术特征摘要】
1.一种预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)用TAK1抗体处理肿瘤组织，然后测定肿瘤组织中TAK1的表达水平，得到R1；同时，用TAK1抗体处理其肿瘤旁边的正常组织，再测定正常组织中TAK1的表达水平，得到R2；(2)比较R1和R2，若R1＜R2差异有显著性，则预测TAK1能与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡；反之，若R1＞R2差异有显著性，则预测TAK1不能与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡，并预测TAK1抑制剂与药物协同促进与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞凋亡。2.根据权利要求1所述的预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的肿瘤组织为肾癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌或乳腺癌；步骤(1)中所述的肿瘤旁的正常组织为去除对应肿瘤后的正常组织；步骤(2)中所述的药物为抗肿瘤药物；步骤(2)中所述的TAK1抑制剂为5Z-7-oxozeaenol，或使用TAK1基因编辑质粒沉默TAK1基因。3.根据权利要求2所述的预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的药物为紫杉醇。4.根据权利要求1所述的预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的TAK1的表达水平的测定为通过免疫组化，流式细胞术检测、定量PCR和免疫印迹中的至少一种方法进行测定；步骤(2)中所述的差异有显著性为通过如下方法进行判断：先进行方差齐性检验，若方差齐则使用两样本均数t检验比较，若方差不齐则使用t’检验比较，当P＜0.05时，认为差异有显著性。5.根据权利要求1所述的预测TAK1与药物协同影响细胞凋亡的方法，其特征在于：在步骤(2)之后还包括进一步验证的步骤；所述的验证可通过如下任一种或两种方法实现：(a)免疫印迹法TAK1/TAB1与药物联合使用：将与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同的肿瘤细胞分别转染空载质粒、含有TAK1基因的质粒、以及含有TAK1和TAB1基因的质粒，然后将转染后的细胞培养48或72小时后加入药物处理9～18h，裂解细胞获得全细胞抽提物，再用免疫印迹法检测PARP剪切；若检测结果显示与转染空载质粒的肿瘤细胞相比，转染含有TAK1基因的质粒以及含有TAK1和TAB1基因的质粒的肿瘤细胞的PARP剪切增强，则验证TAK1与药物协同促进细胞凋亡；反之，若与转染空载质粒的肿瘤细胞相比，转染含有TAK1基因的质粒以及含有TAK1和TAB1基因的质粒的肿瘤细胞的PARP剪切减弱，则验证TAK1不能与药物协同促进肿瘤细胞凋亡；(b)流式细胞术TAK1/TAB1与药物联合使用：将与步骤(1)中的肿瘤组织来源相同...

【专利技术属性】
技术研发人员：邸玉玮，李广华，骆新兰，李卓升，侯铁英，郑有为，
申请(专利权)人：广东省人民医院广东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：广东,44